梁金花，林俊顏，李春河，羅苑苑，陳日墾，鄭珍珍

1.廣東醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 湛江 524000；

2.國家呼吸醫(yī)學中心、呼吸疾病國家重點實驗室、廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科、廣州呼吸健康研究院，廣東 廣州 510120；

3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東 廣州 510120；

4.廣東醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸科，廣東 湛江 524000

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)主要由糖尿病(diabetesmellitus，DM)引起，DM長期影響導致心臟初始舒張功能和晚期收縮功能障礙，與高血壓和冠狀動脈疾病無關(guān)[1]。DM是一個主要的全球健康問題，估計全世界有3.66億人受到影響[2]，并且會導致心力衰竭(HF)的發(fā)生，事實上，高血糖、高脂血癥和胰島素信號傳導中斷可能與DCM的發(fā)展相一致。DCM包括一系列心臟異常，包括心臟肥大、心肌纖維化、糖尿病微血管病、舒張和收縮性心臟功能障礙[3]。心肌細胞內(nèi)脂肪酸代謝升高、脂質(zhì)沉積和葡萄糖代謝受抑制是DCM的主要病理特征[4]。DCM患者胰島素抵抗會導致代謝紊亂，從而上調(diào)與游離脂肪酸攝取和氧化相關(guān)的蛋白質(zhì)表達。增加的脂肪酸β-氧化產(chǎn)生過量的活性氧(ROS)并導致心臟氧化應激，長期氧化應激促進心臟纖維化、心肌細胞肥大和心功能不全，從而加劇DCM的發(fā)展[5-6]。

淫羊藿[Epimedium(yinyanghuo)]別稱仙靈脾，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其化學成分包括4大類，分別為生物堿、木脂素、多糖以及黃酮、多糖與黃酮類化合物的生物活性相對較強，是傳統(tǒng)的溫腎壯陽中藥，具有補腎壯陽、祛風濕、強筋骨等功效，用于治療高血壓、冠心病、骨質(zhì)疏松、更年期綜合征、陽痿、半身不遂、四肢麻木等，淫羊藿還常與其他中藥聯(lián)合用于治療DM及其并發(fā)癥[7-8]。近年來，為了充分發(fā)揮淫羊藿的作用，醫(yī)學領(lǐng)域?qū)ζ溥M行了大量的研究，并在有關(guān)研究不斷推進的過程中取得了諸多研究成果[9-11]。國內(nèi)學者研究顯示淫羊藿總黃酮可能通過降低血糖、抗氧化等途徑對DM小鼠血管內(nèi)皮損傷起到保護作用[12]。其中淫羊藿苷(Icariin)是一種從淫羊藿中分離出來的黃酮類化合物，是淫羊藿中的主要活性成分[13]。有研究揭示了Icariin對各種疾病狀況的治療作用，包括心血管疾病[14-16]和DM誘發(fā)的疾病[17]。Icariin通過多種途徑如抗氧化、抗炎和脂質(zhì)調(diào)節(jié)活性發(fā)揮作用[14]，研究顯示淫羊藿苷通過增加線粒體中sirtuin-1的表達而產(chǎn)生保護心肌細胞免受氧化應激損傷的作用[18]。然而淫羊藿中仍有很多成分如檢測淫羊藿次苷Ⅱ(ICAⅡ)、朝藿定等可能會對心血管疾病發(fā)揮作用，如ICAⅡ能夠上調(diào)miR-181c，激活下游的相關(guān)的信號通路，從而恢復血管內(nèi)皮細胞功能[19]，總體來說目前其他成分的研究還很欠缺。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學分析淫羊藿治療DCM的作用，在基于計算機軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)后，確定了該藥用植物的作用機制，希望為未來開發(fā)淫羊藿相關(guān)有效成分提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 獲取淫羊藿的主要有效活性成分選擇TCMSP平臺檢索淫羊藿所含有的化學成分，再以化合物的藥動力學參數(shù)中的類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，caco-2 permeability≥-0.4和half-life≥3 h為篩選標準，篩選出淫羊藿中主要的有效活性成分。

1.2 有效活性成分的靶點預測以活性成分為關(guān)鍵詞，通過PubChem進行檢索，確定淫羊藿的結(jié)構(gòu)信息，接下來在Swiss Target Prediction平臺中檢索有關(guān)結(jié)構(gòu)信息，確定研究所需的靶點信息。

1.3 DCM相關(guān)靶點預測選擇GeneCards平臺以“diabetic cardiomyopathy”為檢索詞查找DCM相關(guān)靶點信息。將淫羊藿有效活性成分和DCM的有關(guān)靶點信息進行對比分析，確定淫羊藿治療DCM的作用靶點。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在String平臺中導入上一步驟獲得的靶點信息，使用Multiple Proteins，將Organism設(shè)置成Homo Sapiens，接下來向Cytoscape version 3.8.2工具中導入獲得的信息，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)并進行分析，最后獲得研究所需的PPI關(guān)系圖。

1.5 靶點GO富集及KEGG通路注釋分析用R語言對淫羊藿與DCM的共作靶點進行分析，獲得GO富集分析所需的氣泡圖以及條形圖，最后通過轉(zhuǎn)換獲得相應的原始基因靶點。

1.6 靶點KEGG通路富集分析及KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過轉(zhuǎn)換使ID成為相應的文本文件，基于R語言工具處理獲得文本文件、氣泡圖與條形圖。在Cytoscape3.8.2工具中導入通過perl處理后得到的KEGG文件，對KEGG關(guān)系網(wǎng)進行繪制。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿主要有效活性成分與潛在靶點的篩選結(jié)果基于數(shù)據(jù)庫篩選出淫羊藿中主要的有效活性成分有17個，見表1，經(jīng)過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預測并構(gòu)建成分靶點集，得到淫羊藿潛在活性成分靶點551個。

表1 淫羊藿主要有效活性成分Table1 Main activeingredients of Epimedium

2.2 DCM潛在靶點信息基于GeneCards可以得到330個DCM的靶點基因，將已經(jīng)獲得的淫羊藿中有效活性成分作用的靶點基因取交集，可獲得兩者的共同靶點有58個(圖1)。

圖1 淫羊藿與糖尿病心肌病共同靶點韋恩圖Figure 1 Venn diagram of the common target of Epimedium and diabetic cardiomyopathy

2.3 淫羊藿主要有效活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)本研究通過Cytoscape 3.8.2工具繪制的靶點圖(圖2)，圖中綠色、紅色、棕黃色與藍色部分分別對應的是淫羊藿、DCM、活性成分與靶點。節(jié)點的重要程度與連線的密集程度間具有正相關(guān)的關(guān)系，也就是如連線較少，那么節(jié)點的重要性便相對較差，相應的如連線較多，那么節(jié)點的重要程度便相對較高。在STRING中輸入得到的58個靶點信息，可以構(gòu)建出PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，通過R語言提取出中度值居于前30位的基因(圖4)。

圖2 淫羊藿有效活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Theeffectiveactiveingredient-Hub target network of Epimedium

圖3 淫羊藿與糖尿病心肌病靶點PPl網(wǎng)絡(luò)Figure3 PPl network of Epimedium target and diabetic cardiomyopathy target

圖4 PPI的核心基因Figure4 Hub genesof PPI

2.4 淫羊藿-DCM相關(guān)靶點GO富集分析使用R語言對淫羊藿-DCM相關(guān)靶點進行GO富集分析。經(jīng)R語言運行后總共得到74個功能，以前20作為分界，可得到如下兩圖所示的條形圖(圖5)與氣泡圖(圖6)。如富集較少，那么圖形的顏色便相對較為趨近于藍色，如富集較為顯著，那么圖形的顏色便較為趨近于紅色，圖像的橫坐標代表的是富集數(shù)量。GO富集分析描述了淫羊藿治療DCM的靶點參與protein serine/threonine kinase activity、insulin receptor substrate binding、protein kinase C activity和calcium-dependent protein kinase Cactivity等。

圖5 GO富集條形圖Figure5 GO enrichment bar graph

圖6 GO富集氣泡圖Figure 6 GO enrichment bubblediagram

2.5 淫羊藿-DCM相關(guān)靶點KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析及KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建選擇R語言工具，通過該工具進行處理后，得到的通路數(shù)量為159條，根據(jù)顯著性的大小選取居于前20位的通路，并繪制相應的條形與氣泡圖(圖7、圖8)。圖左側(cè)代表通路名稱，橫坐標代表靶點的數(shù)量，如果靶點數(shù)量越少，圖形的顏色便趨近藍色，靶點數(shù)量越多，圖形的顏色便趨近紅色。圖9為進行富集時居于前20位的基因和KEGG通路間的網(wǎng)絡(luò)圖，連線是指相互鏈接，內(nèi)圈與外圈的圓形分別代表的是基因與通路，如圖形的顏色越深，且面積較大，說明相互關(guān)聯(lián)的數(shù)量也越多，通過觀察分析該圖不難發(fā)現(xiàn)KEGG通路與基因之間的網(wǎng)絡(luò)圖中關(guān)聯(lián)數(shù)量較多的基因主要有蛋白激酶B1(AKT1)、磷酸肌醇3激酶催化亞基β(PIK3CB)、磷酸肌醇3激酶催化亞基α(PIK3CA)、磷酸肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基1(PIK3R1)和磷酸肌醇3激酶催化亞基δ(PIK3CD)等。

圖7 KEGG富集條形圖Figure7 KEGG enrichment bar graph

圖8 KEGG富集氣泡圖Figure8 KEGG enrichment bubblemap

圖9 淫羊藿治療糖尿病心肌病的KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Figure 9 KEGG network of Epimedium in the treatment of diabetic cardiomyopathy

3 討論

DM有許多并發(fā)癥，其對心肌的影響較嚴重[20-21]，DM并發(fā)癥嚴重威脅著DM患者的生活質(zhì)量[22]。DCM是DM的嚴重并發(fā)癥之一，死亡率高，被描述為存在心肌功能障礙而沒有任何其他常規(guī)心血管危險因素。DCM主要表現(xiàn)為心肌纖維化、心肌細胞肥大、細胞凋亡和代謝紊亂，最終導致心力衰竭[23-25]，盡管有研究從分子和細胞角度解釋發(fā)病機制，可能涉及過度氧化應激、纖維化、細胞凋亡和高血糖引起的炎癥，但仍有爭議[26-27]。

近年來在治療擴張型心肌病方面的選方用藥表現(xiàn)出更加全面、多樣與系統(tǒng)的特點[28]。通過淫羊藿中的主要成分淫羊藿苷及淫羊藿總黃酮等的有關(guān)動物實驗能夠發(fā)現(xiàn)，在治療擴張型心肌病方面淫羊藿可以發(fā)揮良好的作用，不過與病機相關(guān)的研究相對較少[29-30]。本研究篩選出淫羊藿中主要的有效活性成分有槲皮苷(quercetin)、木樨草素(luteolin)、乙酸亞油醇酯(linoleyl acetate)、山奈酚(kaempferol)等17個，發(fā)現(xiàn)58個靶點對DCM產(chǎn)生作用，利用PPI處理后確定了前5位的靶標，分別為蛋白激酶1(AKT1)、腫瘤壞死因子(TNF)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、腫瘤蛋白p53(p53)和內(nèi)皮型一氧化氮合成酶[NOS3(eNOS)]等，因此推測這5個靶標可能是淫羊藿治療DCM的關(guān)鍵靶點。有研究發(fā)現(xiàn)AKT是信號轉(zhuǎn)導分子，其介導的信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)細胞分裂、分化、凋亡等活動[31]，而達格列凈可上調(diào)AKT/酪氨酸激酶(JAK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路減輕DCM[32]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)是一些主要的促炎細胞因子，參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[33]，一項研究評估了左心室舒張功能障礙的促炎細胞因子水平，這是DM引起左心室功能障礙的最早表現(xiàn)，其發(fā)現(xiàn)血漿IL-6和TNF-α水平升高[34]。研究顯示二甲雙胍改善2型DM引起的左心室損傷中纖維化和血脂異常的活性氧(ROS)-p53-膠原蛋白(collagen)軸，還有研究顯示恢復細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/mTOR通路可預防DCM[35]，而淫羊藿能對Akt/mTOR起到抑制作用，同時還可以使p53激活[36]。Baumgardt等[37]發(fā)現(xiàn)通過BH4/eNOS/NO途徑限制DCM和缺血/再灌注損傷，而Duan等[38]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷激活PI3K/AKT-eNOS通路可延緩內(nèi)皮細胞衰老。

GO富集分析顯示淫羊藿治療DCM的預測靶點參與蛋白絲氨酸蘇氨酸磷酸酶/蘇氨酸激酶激活、胰島素受體底物結(jié)合、蛋白激酶C激活和鈣依賴蛋白激酶C激活等。KEGG富集通路分析顯示淫羊藿治療DCM的主要通路有糖尿病心肌病、HIF-1信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路、胰島素抵抗、生長激素的合成、分泌和作用通路和內(nèi)分泌阻抗通路等，這與PPI網(wǎng)絡(luò)分析及GO富集分析結(jié)果相似。缺氧誘導因子-1(HIF-1)與DCM密切相關(guān)[39]，ROS和HIF1α依賴性IGFBP3上調(diào)阻斷IGF1存活信號，從而介導高糖誘導的心肌細胞凋亡，而外源性硫化氫通過抑制信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)/HIF-1α通路可以防止高糖誘導的細胞凋亡和氧化應激[40]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)AGE及其受體(RAGE)與DCM的發(fā)病機制有關(guān)，抑制RAGE/NF-κB信號通路和下游炎癥因子的表達，對DM大鼠相關(guān)心血管并發(fā)癥具有保護作用[41]。AGE及其與RAGE的相互作用促進細胞的增殖、ECM的積累和抑制細胞凋亡從而誘導血管重塑，AGE和RAGE相互作用產(chǎn)生的ROS調(diào)節(jié)細胞增殖、減弱細胞凋亡和收縮血管[42-43]，淫羊藿苷Ⅱ(ICAⅡ)和二甲雙胍(MET)可降低空腹血糖(FPG)、血紅蛋白A1c(HbA1c)和AGEs水平。ICAⅡ和MET還可能通過PI3K-AKT-mTOR通路增強信號傳導，以減少平滑肌細胞線粒體自噬[44]。生長激素促分泌素(GHS)在內(nèi)分泌、代謝和心血管研究領(lǐng)域開辟了許多新的視角，表明其可能在DM和DM并發(fā)癥尤其是DCM中發(fā)揮治療應用，其可調(diào)節(jié)巨噬細胞和脂肪細胞中的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)，PPAR-γ是胰島素致敏的重要調(diào)節(jié)劑。生長激素釋放肽(Ghrelin)還通過激活PI3K/AKT和c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制對β細胞顯示出保護作用。在胰腺切除大鼠和鏈脲佐菌素治療的新生大鼠中，?；L素釋放肽(AG)和非?；L素釋放肽(UAG)給藥可降低葡萄糖水平并增加產(chǎn)生胰島素的β細胞數(shù)量和胰島素分泌，表明GHS在胰腺再生中可能發(fā)揮作用[41，45]。這些通路被激活可以促進細胞因子的分泌，其中最重要的包括TNF-α，這有助于炎癥反應[46]，而這些細胞因子可以加速DCM的進展。

本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學為基礎(chǔ)，針對淫羊藿治療DCM的作用機制進行研究，結(jié)果表明淫羊藿可能利用多靶點、多成分、多通路抑制氧化應激、炎癥反應、細胞自噬來改善DCM及心肌細胞氧化代謝功能，作用于AKT1、TNF、mTOR、TP53和NOS3(eNOS)等相關(guān)靶點。