李香敏，王華，張春蕾，蒙軍平，張冰，張平

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，陜西 西安 710038；

2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科，陜西 西安 710032

原代骨髓單核細(xì)胞(primary mouse bone marrow monocytes，pBMMC)的培養(yǎng)由于細(xì)胞離體時(shí)間短，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳特性，最接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特點(diǎn)，在藥物測(cè)試、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)化等研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。在細(xì)胞水平進(jìn)行研究，最為關(guān)鍵的是細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，后期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能夠更加穩(wěn)定、可信[1]。由于pBMMC提取步驟復(fù)雜，各實(shí)驗(yàn)室方法不盡相同，培養(yǎng)所得的原代細(xì)胞質(zhì)量不穩(wěn)定。目前常用的提取方法未注意到熱缺血對(duì)細(xì)胞的影響，未進(jìn)行預(yù)冷處理[2-4]。因此，為探索更好的原代小鼠骨髓單核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法，本研究引入“熱缺血”這一概念，進(jìn)而探討熱缺血損傷對(duì)原代骨髓單核細(xì)胞分離提取的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雄性，6~8周齡，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合國(guó)家科技委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑紅細(xì)胞裂解液(康為公司)，DMEM、胎牛血清(GIBCO公司)，巨噬細(xì)胞集落刺激因 子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)(Peprotech公司)，PE anti-mouse F4/80(e Bioscience公司)，APC anti-mouse CD11b(Biolegend公司)，7AAD抗體(BD公司)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)β1和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)購(gòu)自abcam公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器Thermo Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)、超凈工作臺(tái)(美國(guó)，Thermo Scientific)、FACScalibur流式細(xì)胞儀(BD Immunocytometry Systems)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)物品準(zhǔn)備眼科剪、眼科彎鑷、2 mL注射器、1×磷酸鹽緩沖液(PBS)、10 cm培養(yǎng)皿、400目尼龍篩、吸管、酒精燈；紅細(xì)胞裂解液等。

1.2.2 骨髓組織取材(1)預(yù)冷組(pre-cooling group，Pre-cool)：將6~8周齡的小鼠脫臼處死，置于75%酒精中浸泡2 min消毒；在無(wú)菌超凈臺(tái)中，完整取出雙側(cè)股骨，置于預(yù)冷的PBS緩沖液中，剔除殘留肌肉組織；將股骨移至另一平皿中，剪去股骨頭，暴露骨髓腔，用2 mL無(wú)菌注射器吸取PBS自遠(yuǎn)端刺入并沖洗骨髓腔3次，吹打混勻骨髓組織，制成單細(xì)胞懸液；用無(wú)菌400目尼龍篩過濾至15 mL離心管中，1 200 r/min離心4 min(4℃)；棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液3~5 mL(10倍體積)重懸，冰上靜置5 min，加入等體積PBS終止裂紅，同上離心；棄上清，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液3 mL重懸，接種于10 cm平皿中，搖動(dòng)混勻，放入37℃培養(yǎng)箱(5%CO2)。(2)對(duì)照組(control)：操作步驟如上述，所有操作均在室溫進(jìn)行。

1.2.3 向單核巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化將提取的骨髓單核細(xì)胞培養(yǎng)6~8 h后，吸取培養(yǎng)皿中上層懸液即未貼壁的細(xì)胞懸液至15 mL離心管中，同上離心；棄上清，用10%FBS的DMEM培養(yǎng)液3 mL重懸，接種至6孔板培養(yǎng)皿中，加入M-CSF 25 ng/mL，放入37℃培養(yǎng)箱；3 d后進(jìn)行細(xì)胞換液，并加入同濃度M-CSF，7 d后即可得到高純度的單核巨噬細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞純度鑒定用胰蛋白酶消化單核巨噬細(xì)胞，待細(xì)胞呈圓形后，終止消化，輕輕吹打至細(xì)胞完全脫落，移入15 mL離心管，同上離心；棄上清，加入大鼠血清10μL封閉，冰上10 min后，加入40μL流式細(xì)胞液震蕩重懸；加入熒光標(biāo)記的流式細(xì)胞抗體進(jìn)行染色：PE anti-mouse F4/80、APC anti-mouse CD11b，4℃避光，30 min；加入流式細(xì)胞液3 mL，同上離心洗去多余抗體；棄上清，加入500μL含7AAD抗體的流式細(xì)胞液，進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

1.2.5 單核巨噬細(xì)胞功能驗(yàn)證在骨髓單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)第5天時(shí)進(jìn)行細(xì)胞換液，同時(shí)加入TGF-β1(10 ng/mL)M-CSF(25 ng/mL)，培養(yǎng)3 d，即可觀察到細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化。通過Western Blotting檢測(cè)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Prism 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。文中所有數(shù)值均以n個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(standard error of mean，SEM，±s)表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P≤0.05(雙側(cè))為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代骨髓單核巨噬細(xì)胞的形態(tài)在小鼠骨髓單核細(xì)胞培養(yǎng)液中加入M-CSF 25 ng/mL，光鏡下觀察細(xì)胞大小、形態(tài)變化及細(xì)胞增殖情況。1 d后可見細(xì)胞已貼壁，呈圓形，體積較小，散在分布。培養(yǎng)3 d后進(jìn)行換液，同時(shí)補(bǔ)加同濃度M-CSF繼續(xù)誘導(dǎo)，光鏡下可見細(xì)胞增生，部分伸出偽足(圖1)。

圖1 培養(yǎng)3 d時(shí)光鏡下小鼠骨髓單核巨噬細(xì)胞圖片(20×；bar：50μm)Figure 1 Bone marrow mononuclear macrophage of mice cultured for 3 days(20×;bar:50μm)

2.2 小鼠原代骨髓單核巨噬細(xì)胞純度鑒定收集培養(yǎng)7 d的骨髓單核巨噬細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓單核巨噬細(xì)胞表面抗原，結(jié)果顯示對(duì)照組CD11b+F4/80+的細(xì)胞比例占94.8%，預(yù)冷組為96.3%，較對(duì)照組細(xì)胞純度有所升高，采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05(圖2)。

圖2 骨髓單核巨噬細(xì)胞流式細(xì)胞儀純度鑒定Figure2 Purity identification of bonemarrow mononuclear macrophagesby flow cytometry

2.3 小鼠原代骨髓單核巨噬細(xì)胞功能驗(yàn)證在加入TGF-β1共培養(yǎng)后可見部分細(xì)胞死亡，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，呈細(xì)長(zhǎng)紡錘形，如圖3所示。通過Western Blotting進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05(圖4)。

圖3 培養(yǎng)7 d后BMDM的細(xì)胞形態(tài)及加入TGF-β1誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化Figure 3 Cell morphology of BMDM after 7 days of culture and morphological changesof cells after TGF-β1 induction

圖4 小鼠骨髓單核巨噬細(xì)胞功能驗(yàn)證Figure 4 Functional verification of bone marrow mononuclear macrophages of mouse

3 討論

原代骨髓單核細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞離體時(shí)間短，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳特性，最接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特點(diǎn)，在藥物測(cè)試、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)化等研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。在細(xì)胞水平進(jìn)行研究，最為關(guān)鍵的是細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，后期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能夠更加穩(wěn)定、可信[1]。因此，在分離提取細(xì)胞的過程中，盡可能地消除一些可控因素，減少對(duì)細(xì)胞可能產(chǎn)生的損傷。但由于pBMMC提取步驟復(fù)雜，各實(shí)驗(yàn)室操作方法不盡相同。目前，pBMMC的提取方法主要有三種：(1)密度梯度離心法：該方法的原理是根據(jù)不同細(xì)胞間密度的差別進(jìn)行細(xì)胞分離，分離效果好，但操作嚴(yán)格，不易掌握。(2)免疫磁珠分離法：該法是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合的原理，分為正選法和負(fù)選法。在正選法中，磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞；而在負(fù)選法中，磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于上清液中的細(xì)胞為目的細(xì)胞。這是一種簡(jiǎn)單高效的分離方法，僅需磁性分離器，不需要專業(yè)設(shè)備輔助；但需要將提取的細(xì)胞標(biāo)記抗體并進(jìn)行磁珠分選，耗時(shí)長(zhǎng)，且容易污染。(3)差速貼壁法：是利用成纖維細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和成鞘細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同而將它們分離的方法。本研究在原有差速貼壁法的基礎(chǔ)上，引入“熱缺血”這一概念，縮短細(xì)胞離體后的熱缺血時(shí)間，減輕細(xì)胞熱缺血損傷，維持細(xì)胞處于良好的狀態(tài)，提高細(xì)胞質(zhì)量，以保障后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)室采用第三種方法提取pBMMC，該方法的優(yōu)勢(shì)在于操作相對(duì)簡(jiǎn)單，初學(xué)者容易掌握；且提取過程相對(duì)較快，從細(xì)胞離體到放入培養(yǎng)箱的時(shí)間較短，不易污染。目前常用的分離提取方法未注意到熱缺血對(duì)細(xì)胞的影響，未進(jìn)行預(yù)冷處理[2-4]，培養(yǎng)所得的原代細(xì)胞的熱缺血損傷較重。因此，探索熱缺血在原代骨髓單核細(xì)胞的分離提取中的影響具有重要的意義。

器官?gòu)墓w供血停止到冷灌注(冷保存)開始的這段時(shí)間血流中斷，但是器官組織仍繼續(xù)進(jìn)行代謝，因氧和各種代謝底物供應(yīng)缺乏而器官仍處于較高的代謝水平，所以器官缺血損害出現(xiàn)較快、程度較重，對(duì)器官的損害最為嚴(yán)重[5-7]。因此，縮短熱缺血時(shí)間在原代細(xì)胞分離培養(yǎng)中具有重要意義。本研究中引入“熱缺血”這一概念，細(xì)胞自離體到放入培養(yǎng)箱這一段時(shí)間內(nèi)，盡可能在冰上操作，保持細(xì)胞在0℃~4℃，縮短熱缺血時(shí)間，盡量減少對(duì)細(xì)胞帶來(lái)的損傷。本實(shí)驗(yàn)中將小鼠脫臼處死后在75%的酒精中浸泡消毒時(shí)間有5 min縮短為2 min，在取出股骨的后續(xù)操作均在冰上進(jìn)行，包括殘留肌肉組織的剔除、骨髓腔的沖洗、尼龍篩過濾及紅細(xì)胞裂解這些步驟，有效縮短了細(xì)胞的熱缺血時(shí)間。在放入培養(yǎng)箱6~8 h后，留取培養(yǎng)皿中上層懸液，棄去已貼壁的成纖維細(xì)胞等，培養(yǎng)液中同時(shí)加入定向誘導(dǎo)因子M-CSF，促進(jìn)單核細(xì)胞向單核巨噬細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化。3 d后進(jìn)行細(xì)胞換液，去除凋亡細(xì)胞及細(xì)胞有害產(chǎn)物，7 d后即可獲得生物學(xué)特性保持良好的原代小鼠骨髓單核巨噬細(xì)胞。CD11b是單核細(xì)胞的表面標(biāo)志性抗原，F(xiàn)4/80是巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志性抗原，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示單核細(xì)胞的純度為96.3%。在第5天時(shí)加入TGF-β1共培養(yǎng)3 d后細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞，α-SMA的表達(dá)升高，證明所提取的原代小鼠骨髓單核細(xì)胞狀態(tài)良好、功能穩(wěn)定，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

總之，減少消毒時(shí)間，加快小鼠股骨的剝離，后續(xù)在冰上進(jìn)行操作，縮短細(xì)胞熱缺血時(shí)間，能夠有效地減低骨髓細(xì)胞損傷，可獲得狀態(tài)良好純度高的小鼠骨髓單核巨噬細(xì)胞。