馬彥娥，符號，郝光軍，李婷

榆林市第一醫(yī)院腫瘤診療中心，陜西 榆林 719000

肺癌患病人數(shù)多，以非小細胞肺癌為主，約占所有新發(fā)癌癥的13%。多數(shù)患者在首次診斷時，常因病情嚴重(中晚期)而失去外科手術的最佳機會，其5年生存率低[1]。目前，抗腫瘤藥物治療是延長中晚期患者生命的主要方法。靶向治療是在細胞分子水平上，針對已經(jīng)明確的致癌位點的治療方式。在非小細胞肺癌中，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是常見的驅(qū)動基因，其突變率高達60%[2]。臨床常使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)對此類患者進行靶向治療，而獲得性耐藥是影響療效的關鍵因素，因此，探討與EGFR-TKIs耐藥相關的輔助指標對療效的改善有積極意義[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)參與多種疾病的病理過程，其中微小RNA-532-3p(microRNA-532-5p，miR-532-3p)在腫瘤中起到了重要作用[4]。而有絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein-kinase，MAPK)級聯(lián)是調(diào)節(jié)增殖和應激反應等多種細胞過程的關鍵信號通路，在腫瘤血管生成中也具有重要作用[5]。但miR-532-3p、MAPK在非小細胞肺癌中的表達及其與患者靶向治療耐藥的相關性尚有待驗證。本研究通過檢測非小細胞肺癌患者的血清miR-532-3p、MAPK水平，分析兩者與化療有效率及患者5年生存期的關系，旨在為靶向治療藥物的選擇提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2013年6月至2016年1月期間榆林市第一醫(yī)院腫瘤診療中心收治的30例EGFR基因突變非小細胞肺癌患者作為耐藥組，均為EGFR-TKIs耐藥患者，其中臨床分期Ⅲ期15例、Ⅳ期15例。EGFR-TKIs耐藥均為獲得性耐藥，即EGFR-TKIs治療有臨床獲益，但之后出現(xiàn)腫瘤進展。耐藥組納入標準：(1)病理結果顯示為非小細胞肺癌；(2)DNA測序證實為EGFR基因突變；(3)無其他部位腫瘤；(4)首次治療者。排除標準：(1)有遠處轉(zhuǎn)移者；(2)不能堅持服藥者；(3)既往有肺部手術史者；(4)病情嚴重，且預計生存時間在1年內(nèi)者。選取同期于榆林市第一醫(yī)院腫瘤診療中心治療的非小細胞肺癌EGFR-TKIs非耐藥患者32例為非耐藥組，其中臨床分期Ⅲ期21例、Ⅳ期11例。非耐藥組納入標準：(1)病理結果顯示為非小細胞肺癌；(2)無其他部位腫瘤；(3)首次治療者。排除標準與耐藥組一致。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 藥物服用方法患者接受一線標準治療方案，包括?？颂婺帷⒍蚵逄婺?、阿法替尼及吉非替尼，具體藥物的選擇依據(jù)患者病情進行評估。

1.2.2 血清標本采集于清晨利用采血管收集患者空腹外周靜脈血，每例5 mL，在4℃、3 000 r/min的離心機中離心，離心時間為15 min，分離血清，用于檢測血清miR-532-3p、MAPK水平。

1.2.3 血清miR-532-3p水平檢測以實時熒光定量PCR法并按照試劑盒中的步驟檢測血清miR-532-3p水平。使用Trizol試劑(貨號：NR0002，北京雷根生物技術有限公司)從血清中抽提總RNA，合格標準為：吸光度A260/A280值在1.8~2.0之間，使用反轉(zhuǎn)錄試劑(貨號：k1622，北京蘭博康斯科技有限公司)將合格的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應體系20μL，其中正向和反向引物各2μL、cDNA 2μL、PCRMix 10μL、補水至20μL。反應條件：95℃、10 min，95℃、15 s，72℃、15 s，共35個循環(huán)。通過比較Ct值并利用公式2-△△Ct計算miR-532-3p的相對表達量。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table1 PCR primer sequence

1.2.4 血清MAPK水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測MAPK水平，絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶(MAPK)酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(貨號：ml122748，上海酶聯(lián)生物)，嚴格按照試劑盒方法操作。

1.3 療效評價標準[6]患者完全緩解(complete relief，CR)為治療后靶病灶完全消失，持續(xù)≥4周無新發(fā)病灶；患者部分緩解(partial relief，PR)為靶病灶縮小≥50%，且持續(xù)≥4周并無新發(fā)病灶；患者進展(progressive disease，PD)為靶病灶增大≥25%或有新發(fā)病灶；患者穩(wěn)定(stable disease，SD)介于PR及PD之間。其中有效為CR、PR、SD例數(shù)之和，無效為PD。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS25.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法分析血清miR-532-3p、MAPK表達水平與5年生存期的關系；非小細胞肺癌患者預后不良的影響因素以Cox回歸模型進行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的一般資料比較兩組患者的性別、年齡、吸煙史、肺癌類型、臨床分期、分化程度及服藥種類等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2和表3。

表2 兩組患者的性別、年齡以及吸煙史比較[±s，例(%)]Table 2 Comparison of gender,age,smoking history between the two groupsof patients[±s，n(%)]

表2 兩組患者的性別、年齡以及吸煙史比較[±s，例(%)]Table 2 Comparison of gender,age,smoking history between the two groupsof patients[±s，n(%)]

組別非耐藥組耐藥組χ2/t值P值例數(shù)32 30男15(46.88)14(46.67)女17(53.13)16(53.33)年齡(歲)60.45±5.46 60.26±5.17 0.140 0.889吸煙史10(31.25)13(43.33)0.969 0.325 0.000 0.987性別

表3 兩組患者的肺癌類型、臨床分期、分化程度及服藥種類比較[±s，例(%)]Table3 Comparison of type of lung cancer,clinical stages,degree of differentiation,and type of medication between thetwo groups of patients[±s，n(%)]

表3 兩組患者的肺癌類型、臨床分期、分化程度及服藥種類比較[±s，例(%)]Table3 Comparison of type of lung cancer,clinical stages,degree of differentiation,and type of medication between thetwo groups of patients[±s，n(%)]

腺癌15(46.88)14(46.67)0.023 0.989鱗癌10(31.25)9(30.00)腺鱗癌7(21.88)7(23.33)Ⅳ期11(34.38)15(50.00)1.552 0.213Ⅲ期21(65.63)15(50.00)高分化12(37.50)16(53.33)中低分化20(62.50)14(46.67)厄洛替尼6(18.75)8(26.67)阿法替尼7(21.88)5(16.67)吉非替尼9(28.13)6(20.00)?？颂婺?0(31.25)11(36.67)1.203 0.752組別非耐藥組耐藥組χ2值P值例數(shù)32 30肺癌類型 臨床分期 分化程度 服藥種類1.567 0.211

2.2 兩組患者的血清miR-532-3p、MAPK水平比較與非耐藥組比較，耐藥組患者的血清miR-532-3p水平明顯升高，血清MAPK水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 兩組患者的血清miR-532-3p、MAPK水平比較(±s)Table4 Comparison of serum miR-532-3p and MAPK levelsbetween thetwo groupsof patients(±s)

表4 兩組患者的血清miR-532-3p、MAPK水平比較(±s)Table4 Comparison of serum miR-532-3p and MAPK levelsbetween thetwo groupsof patients(±s)

例數(shù)32 30組別非耐藥組耐藥組t值P值miR-532-3p 1.05±0.16 2.09±0.24 20.194 0.001 MAPK(mg/L)7.63±3.28 1.04±0.57 10.847 0.001

2.3 血清miR-532-3p、MAPK表達水平與化療客觀有效率的關系本研究以血清miR-532-3p水平(2.09)、MAPK水平(1.04)平均值為界，將患者分別分為miR-411-3p高、低表達組和MAPK高、低表達組?；?個周期(21 d為一個周期)后，miR-532-3p低表達患者治療有效率高于miR-532-3p高表達患者，MAPK低表達患者治療有效率低于MAPK高表達患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表5。

表5 血清miR-532-3p、MAPK表達水平與化療客觀有效率的關系(例)Table5 Relationship between theexpression levelsof serum miR-532-3p and MAPK and theobjectiveresponserateof chemotherapy(n)

2.4 血清miR-532-3p、MAPK表達水平與患者5年生存期的關系隨訪5年，非小細胞肺癌患者生存42例，死亡20例。Kaplan-Meier分析結果顯示，血清miR-532-3p低表達患者5年累積生存率為84.4%，高于血清miR-532-3p高表達者的50.0%，差異有統(tǒng)計學意義(Log-rankχ2=9.772，P＜0.05)；血清MAPK低表達患者5年累積生存率為61.3%，低于血清MAPK高表達者的74.2%，但差異無統(tǒng)計學意義(Log-rankχ2=1.969，P＞0.05)，見圖1、圖2。

圖1 血清miR-532-3p表達水平與患者5年生存期的關系Figure 1 Relationship between serum miR-532-3p expression and 5-year survival of patients

圖2 血清MAPK表達水平與患者5年生存期的關系Figure 2 Relationship between serum MAPK expression and 5-year survival of patients

2.5 影響患者預后不良的因素由于耐藥組患者的病例數(shù)較少，除本研究觀察指標miR-532-3p、MAPK外，將臨床高度關注的臨床分期納入Cox回歸模型分析。結果顯示，MAPK低表達、miR-532-3p高表達是非小細胞肺癌患者發(fā)生靶向治療耐藥的獨立危險因素(P＜0.05)，見表6。

表6 Cox回歸模型分析影響非小細胞肺癌患者預后不良的因素Table 6 Cox regression model analysisof factorsinfluencing poor prognosisof patientswith non-small cell lung cancer

3 討論

肺癌患者由于早期出現(xiàn)的癥狀常不具有特異性，易錯失手術機會，常需抗腫瘤藥物治療來延長生存時間。EGFR基因突變患者常用靶向藥物(如?？颂婺帷⒓翘婺岬?控制腫瘤的生長和擴散，獲得更長的生存期。但治療過程中產(chǎn)生的耐藥性可影響藥物發(fā)揮作用[7]。因此，尋找能早期反映靶向治療耐藥性的輔助指標，對治療方案的選擇及臨床療效的提高可能有幫助。

miR-532-3p已被證實在多種腫瘤中具有抑癌作用，且參與腫瘤耐藥的發(fā)生。miR-532-3p通過3'端非翻譯區(qū)的直接結合作用和對轉(zhuǎn)錄活性的間接抑制作用進行調(diào)控[8]。Wang等[9]報道顯示，肝細胞癌組織中miR-532-3p的表達水平較高，miR-532-3p表達與腫瘤直徑、血管侵犯及TNM分期有關。而陳新華等[10]研究顯示，胃癌組織中miR-532-3p表達下調(diào)與腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關，其表達變化與胃癌病情密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，與非耐藥組血清miR-532-3p水平相比，耐藥組血清miR-532-3p水平升高，miR-532-3p低表達患者治療有效率高于miR-532-3p高表達患者，與Wang等[9]研究類似，提示miR-532-3p表達升高與EGFR-TKIs靶向治療耐藥有關，且miR-532-3p表達可作為評估患者化療療效的指標。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清miR-532-3p低表達非小細胞肺癌患者具有更高的5年累積生存率，考慮可能與化療3個周期后，血清miR-532-3p低表達患者治療有效率較高有關。

MAPK級聯(lián)是調(diào)節(jié)包括細胞增殖、分化和應激反應在內(nèi)的基本過程的中心信號元件，可通過連續(xù)激活三到五層蛋白激酶來傳遞信號，MAPK通路在腫瘤生成及轉(zhuǎn)移中具有重要作用[11]。有研究顯示，MAPK通路參與調(diào)節(jié)肺癌、胃癌等癌癥患者化療藥物的耐藥性[12]。江雪蓮等[13]研究報道，MAPK/ERK信號通路的活化形式與卵巢癌細胞的增殖及凋亡有關，抑制該信號通路對臨床治療卵巢癌有幫助。本研究中，EGFR-TKIs耐藥患者血清MAPK水平顯著低于EGFR-TKIs非耐藥患者，且MAPK高表達者治療有效率為70.97%，較MAPK低表達者高，提示MAPK表達降低可能參與耐藥性的發(fā)生，且檢測MAPK表達可能對評估患者化療療效有積極意義。本研究生存分析還發(fā)現(xiàn)，血清MAPK高表達非小細胞肺癌患者5年累積生存率雖高于血清MAPK低表達患者，但差異無統(tǒng)計學意義。今后需擴大研究對象繼續(xù)探討MAPK與患者長期預后的關系，以得到可靠結論。最后本研究多因素Cox回歸模型分析顯示，miR-532-3p高表達、MAPK低表達均與靶向治療耐藥的發(fā)生獨立相關，提示miR-532-3p表達上調(diào)及MAPK表達下調(diào)可能促進患者發(fā)生靶向治療耐藥，但具體機制尚需補充相關實驗進行驗證。

綜上所述，非小細胞肺癌患者血清miR-532-3p水平升高及MAPK水平降低與EGFR-TKIs耐藥有一定關系，兩者均可作為評估EGFR-TKIs耐藥的血清指標，且與患者預后密切相關。