殷旭東，蔣明星

(昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214)

高分子材料通過物理或化學(xué)交聯(lián)的方式形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠，水凝膠可以吸收和保存大量的水[1]。水凝膠的高分子主鏈或者側(cè)鏈上存在著親水和離子化的基團(tuán)，從而具有類似生物體活性的特征[2]。水凝膠這種特殊的結(jié)構(gòu)，使其在3D細(xì)胞培養(yǎng)和藥物輸送等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有許多應(yīng)用[3-4]。殼聚糖(CS)、透明質(zhì)酸、海藻酸、纖維素、明膠等天然高分子材料[5-6]可以形成多種形式的水凝膠，并且具有良好的生物相容性和可降解性等顯著特點(diǎn)[7-8]。其中，CS是自然界中帶陽離子的多糖，具有良好的組織相容性和抑菌性能，廣泛用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[9-10]。CS分子含有大量的氨基和羥基等親水基團(tuán)，很容易和其它分子形成水凝膠[11-12]。CS水凝膠在細(xì)胞培養(yǎng)方面顯示了較好的應(yīng)用價值[13]。但是，CS只在鹽酸、乳酸、乙酸等無機(jī)或有機(jī)酸中溶解[14]，因此在制備CS水凝膠時，要先將CS溶解于酸性水溶液中，這樣形成的CS水凝膠中含有酸性物質(zhì)，不利于在組織工程中的應(yīng)用。為了克服CS不溶于水的缺點(diǎn)，研究人員對CS進(jìn)行了多種改性、共聚或者接枝，使得CS衍生物既保持了生物活性，又能夠更方便地用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[15-16]。N-琥珀?；瘹ぞ厶?NSC)為CS的重要衍生物之一，其不僅具有良好的生物相容性，還可作為藥物載體[17]。

谷氨酸(GA)為人體所必需的氨基酸，在食品工業(yè)中可用作調(diào)味劑，也經(jīng)常用于細(xì)胞培養(yǎng)[18]，對于腫瘤細(xì)胞的分化具有抑制作用[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，GA可以和NSC形成GA/NSC水凝膠，可用作細(xì)胞培養(yǎng)支架和藥物的輸送載體。

作者在室溫條件下，以一定質(zhì)量的GA和NSC在水溶液中通過自組裝制備GA/NSC水凝膠，表征GA/NSC水凝膠的結(jié)構(gòu)，并研究GA/NSC水凝膠的主要性能和細(xì)胞毒性。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

殼聚糖(CS)，美侖生物技術(shù)有限公司；谷氨酸(GA)、琥珀酸酐、二甲基亞砜(DMSO)、氫氧化鈉、無水乙醇，均為分析純。

真空干燥箱，上海一恒儀器有限公司；FD1.0-60E型冷凍干燥機(jī)，丹麥Heto公司；EPUINOX55型紅外光譜儀，德國Bruker公司；JSM-T300型掃描電鏡，德國JEOL公司；PT-10型差示掃描量熱儀(DSC)，德國Linseis公司；Bio-Rad多功能酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 NSC的制備

在磁力攪拌下，將2.0 g CS加入盛有40 mL DMSO的三口瓶中溶解；將4.0 g琥珀酸酐溶于20 mL DMSO中，并逐滴加入三口瓶中，65 ℃反應(yīng)6 h；過濾去除溶劑，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)入燒杯中，加入100 mL無水乙醇，室溫下反應(yīng)1 h；用40%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至10～12，過濾；然后將反應(yīng)物溶解于去離子水中，用無水乙醇反復(fù)沉淀；將白色沉淀在45 ℃下真空干燥。NSC的制備路線[21]如圖1所示。

圖1 NSC的制備路線Fig.1 Preparation route of NSC

1.2.2 GA/NSC水凝膠的制備

將1.5 g GA溶解于98.5 g去離子水中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的GA水溶液。將2 g NSC溶解于98 g去離子水中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NSC水溶液。將20 mL NSC水溶液加入到100 mL小燒杯中，在磁力攪拌下，逐滴加入10 mL GA水溶液，靜置5 min，形成GA/NSC水凝膠。

1.2.3 GA/NSC水凝膠的穩(wěn)定性測試

取一定質(zhì)量的GA/NSC水凝膠浸入去離子水中，在磁力攪拌下，分別逐滴加入0.1 mol·L-1NaOH溶液或0.1 mol·L-1鹽酸溶液，測定pH值，觀察水凝膠的變化。

1.2.4 GA/NSC水凝膠溶脹度的測定

稱取一定量的真空干燥后的GA/NSC水凝膠(m1)置于燒杯中，加去離子水溶脹，每隔30 min取出，用濾紙吸去多余的水，稱量GA/NSC水凝膠質(zhì)量(m2)，按式(1)計算GA/NSC水凝膠的溶脹度(SR，%)：

(1)

1.2.5 CS、GA、NSC和GA/NSC水凝膠的紅外光譜測試

分別將CS、GA、NSC和真空干燥后的GA/NSC水凝膠固體與溴化鉀混合壓片后，進(jìn)行紅外光譜測試。

1.2.6 GA/NSC水凝膠的DSC測試

將真空干燥的GA/NSC水凝膠5.6 mg置于坩堝內(nèi)，在N2氣氛下25～300 ℃范圍內(nèi)進(jìn)行DSC測試，升溫速率為10 ℃·min-1。

1.2.7 GA/NSC水凝膠的掃描電鏡測試

將GA/NSC水凝膠經(jīng)過-80 ℃冷凍干燥后，用掃描電鏡觀察其形貌特征。

1.2.8 GA/NSC水凝膠的體外細(xì)胞毒性檢測

將L929細(xì)胞在含有5%青霉素-鏈霉素、10%胎牛血清蛋白的RPMI 1640滅菌培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用細(xì)胞計數(shù)板計算L929細(xì)胞濃度后接種于96孔板中，細(xì)胞密度為每孔3 000 CFU，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將2%NSC水溶液和凍干GA/NSC水凝膠消毒滅菌處理后加入細(xì)胞板中，分別在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入20 μL MTT溶液，再培養(yǎng)4 h，細(xì)胞生成藍(lán)色的MTT結(jié)晶。加入0.15 mL DMSO，振蕩溶解MTT結(jié)晶，用酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度。設(shè)置空白組(細(xì)胞培養(yǎng)基)和陰性對照組(細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞)。按式(2)計算各組的細(xì)胞存活率(%)：

(2)

式中：ODexp、ODblank和ODnc分別為實驗組、空白組和陰性對照組的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 GA/NSC水凝膠的形成機(jī)制(圖2)

圖2 GA/NSC水凝膠的形成機(jī)制Fig.2 Formation mechanism of GA/NSC hydrogels

2.2 GA/NSC水凝膠的穩(wěn)定性(圖3)

圖3 冷凍干燥前(a)、后(b)的GA/NSC水凝膠照片F(xiàn)ig.3 Photos of GA/NSC hydrogels before(a) and after(b) freeze-drying

由圖3可以看出，GA/NSC水凝膠呈半透明狀，凍干的GA/NSC水凝膠呈白色有孔的泡沫狀。GA/NSC水凝膠在去離子水中經(jīng)過長時間的浸泡不會發(fā)生溶解。向GA/NSC水凝膠中逐滴加入0.1 mol·L-1NaOH溶液，在pH>8.7時，GA/NSC水凝膠會逐漸溶解；向GA/NSC水凝膠中逐滴加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液，在pH<4.2時，GA/NSC水凝膠亦會逐漸溶解。表明，GA/NSC水凝膠對酸堿敏感，為pH響應(yīng)的水凝膠。

2.3 GA/NSC水凝膠的溶脹性能

GA/NSC水凝膠的溶脹度隨時間的變化曲線如圖4所示。

圖4 GA/NSC水凝膠的溶脹曲線Fig.4 Swelling curve of GA/NSC hydrogels

由圖4可以看出，隨著時間的延長，GA/NSC水凝膠的溶脹度逐漸增大，當(dāng)時間達(dá)到3.5 h時，溶脹度為614%，之后溶脹度趨于穩(wěn)定。表明，GA/NSC水凝膠有較好的溶脹性能。

2.4 GA/NSC水凝膠的紅外光譜(圖5)

圖5 CS、GA、NSC、GA/NSC水凝膠的紅外光譜Fig.5 IR spectra of CS，GA，NSC，and GA/NSC hydrogels

由圖5可以看出，CS的紅外光譜在3 300～3 500 cm-1處，出現(xiàn)-OH伸縮振動和-NH2伸縮振動重疊峰；在1 155 cm-1和1 092 cm-1處分別出現(xiàn)一次-OH和二次-OH的伸縮振動吸收峰；在2 876 cm-1處出現(xiàn)C-H伸縮振動吸收峰。由于CS分子中含有一定量的乙酰氨基，所以CS有酰氨基的3個特征吸收峰，分別在1 596 cm-1處(酰胺-Ⅰ譜帶)、1 424 cm-1處(酰胺-Ⅱ譜帶)和1 381 cm-1處(酰胺-Ⅲ譜帶)。與CS相比，在NSC的紅外光譜中，在1 638 cm-1處出現(xiàn)仲酰胺C=O伸縮振動吸收峰，說明CS分子的-NH2發(fā)生反應(yīng)；在1 547 cm-1處出現(xiàn)COO-反對稱伸縮振動強(qiáng)吸收峰，說明NSC分子引入了羧基；在1 064 cm-1和1 026 cm-1處出現(xiàn)-OH伸縮振動吸收峰，沒有明顯變化，表明，CS的-OH沒有發(fā)生反應(yīng)。

2.5 GA/NSC水凝膠的DSC曲線(圖6)

圖6 GA/NSC水凝膠DSC曲線Fig.6 DSC curve of GA/NSC hydrogels

2.6 GA/NSC水凝膠的形態(tài)學(xué)特征

GA/NSC水凝膠經(jīng)過冷凍干燥后的掃描電鏡照片如圖7所示。

圖7 GA/NSC水凝膠冷凍干燥后的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.7 SEM image of GA/NSC hydrogels after freeze-drying

由圖7a可以看出，GA/NSC水凝膠中的水結(jié)冰升華后形成了多孔結(jié)構(gòu)，孔徑在幾十到幾百微米之間，這種結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的培養(yǎng)。從圖7b可以看出，NSC晶體對GA/NSC水凝膠有連結(jié)作用。

2.7 GA/NSC水凝膠的體外細(xì)胞毒性

水凝膠在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用對于無毒性的要求是必要的。對GA/NSC水凝膠進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評價，結(jié)果如圖8所示。

圖8 GA/NSC水凝膠的體外細(xì)胞毒性Fig.8 In vitro cytotoxicity of GA/NSC hydrogels

由圖8可以看出，L929細(xì)胞在NSC水溶液和GA/NSC水凝膠中分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，細(xì)胞存活率均高于90%。表明，GA/NSC水凝膠具有良好的生物相容性。

3 結(jié)論

(1) 以琥珀酸酐、殼聚糖為原料制備水溶性的N-琥珀酰化殼聚糖(NSC)，再以谷氨酸(GA)為交聯(lián)劑，在室溫條件下，一定質(zhì)量的GA和NSC在水溶液中通過自組裝制備GA/NSC水凝膠。

(2)GA/NSC水凝膠為pH響應(yīng)的離子交聯(lián)水凝膠，具有較好的溶脹性能。

(3)體外細(xì)胞毒性結(jié)果表明，GA/NSC水凝膠具有良好的生物相容性。