響應(yīng)面法優(yōu)化阿里紅總?cè)扑崽崛」に嚰翱寡趸钚匝芯?/h1>
2023-01-18 03:37:16吳欣恬阿吉爾古麗麥麥提高哈爾巴克別爾王詩(shī)瑤何文靜
化學(xué)與生物工程 2023年1期
吳欣恬，阿吉爾古麗·麥麥提，高哈爾·巴克別爾，王詩(shī)瑤，何文靜
(新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017)
阿里紅(FomesofficinalisAmes,FOA),在維語(yǔ)中多被譯為“哈日混”，又稱(chēng)麻西芒，來(lái)源于擔(dān)子菌綱多孔菌科層孔菌屬植物苦白蹄的干燥子實(shí)體，在我國(guó)新疆、云南、四川、吉林、黑龍江等地分布廣泛，也是新疆維吾爾族民間常用藥物[1]。據(jù)《中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書(shū)》記載，其性味干熱微辛，有祛寒止痛、燥濕平喘、利尿通經(jīng)等功效，用于治療寒性感冒、胸痛、關(guān)節(jié)痛、閉尿閉經(jīng)、慢性氣管炎等癥[2]。研究表明，阿里紅富含三萜酸類(lèi)、多糖類(lèi)、倍半萜類(lèi)、脂肪酸類(lèi)等化合物，其中三萜酸類(lèi)化合物是阿里紅發(fā)揮藥效的重要活性成分，具有抗炎抗菌、抗腫瘤、抗氧化、祛痰止咳、鎮(zhèn)痛、降血糖血脂等多種藥理作用[3-6]。
目前，三萜酸類(lèi)化合物的提取方法包括溶劑浸提法、超高壓提取法、機(jī)械化學(xué)提取法、超聲輔助提取法、酶解提取法、微波提取法等[7-10]，其中超聲輔助提取法易于操作、節(jié)省溶劑、提取效率高、對(duì)環(huán)境友好，被廣泛用于植物三萜酸類(lèi)化學(xué)成分的提取。黑棗三萜酸[7]、棗果三萜酸[11]、柿果皮總?cè)扑醄12]等的超聲輔助提取工藝均已被報(bào)道。近年來(lái)，有研究[13-15]顯示三萜酸類(lèi)化合物具有抗氧化作用，可以作為潛在抗氧化劑。目前，關(guān)于阿里紅總?cè)扑?total triterpenoid acids fromFomesofficinalisAmes,FOATTA)的提取及其抗氧化活性的研究報(bào)道較少。鑒于此，作者以黑龍江、新疆、吉林、云南等6個(gè)產(chǎn)地阿里紅為原料，采用超聲輔助法提取FOATTA，以FOATTA得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，比較不同產(chǎn)地FOATTA得率及抗氧化活性的差異，旨在為阿里紅資源的深入開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。
1 實(shí)驗(yàn)
1.1 材料、試劑與儀器
新疆阿勒泰阿里紅(批號(hào)191209)，新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院；新疆伊犁阿里紅(批號(hào)211203)，新疆烏魯木齊維藥藥材市場(chǎng)；黑龍江阿里紅(批號(hào)191008)、吉林阿里紅(批號(hào)191225)、云南昆明阿里紅(批號(hào)191116)、云南大理阿里紅(批號(hào)191218)，亳州億弘堂藥業(yè)有限公司。
齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、VC標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH自由基，純度(HPLC)≥99%，上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵，分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；MAX-C6002型電子天平，深圳無(wú)限量衡器有限公司；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；Sigma-4k15型冷凍離心機(jī)，北京卓明貿(mào)易有限公司；722S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
精密稱(chēng)取干燥至恒重的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg于25 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，得濃度為0.2 mg·mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃下密封保存，備用。
1.2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇[3]
移取1 mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于15 mL具塞試管中，于80 ℃恒溫水浴鍋中至溶劑揮干，然后加入現(xiàn)配的5%香草醛-冰醋酸溶液(稱(chēng)取0.5 g香草醛，用冰醋酸定容至10 mL)0.4 mL和高氯酸溶液1.6 mL，搖勻，于60 ℃恒溫水浴鍋中水浴15 min；取出冷卻后，加入8 mL冰醋酸，搖勻，靜置反應(yīng)10 min,以空白試劑(除標(biāo)準(zhǔn)溶液以外的試劑配制)為參比，在450～650 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其最大吸收峰在547 nm處。因此，選擇測(cè)定波長(zhǎng)為547 nm。
1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
分別移取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于15 mL具塞試管中，按照1.2.2方法測(cè)定547 nm處吸光度。以齊墩果酸質(zhì)量濃度(c，mg·mL-1)作橫坐標(biāo)、吸光度(A)作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，擬合得到線(xiàn)性回歸方程為A=48.929c+0.0027，R2=0.9993。
1.2.4 總?cè)扑岬寐实臏y(cè)定
將干燥的阿里紅用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩。精密稱(chēng)取1.0 g阿里紅粉末，將超聲功率設(shè)定為200 W、提取溫度設(shè)定為50 ℃，在一定的料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間條件下提取FOATTA；抽濾，5 000 r·min-1離心10 min，上清液用相應(yīng)提取溶劑定容；移取1.0 mL適當(dāng)稀釋?zhuān)缓笕?.2 mL樣品溶液于15 mL具塞試管中，按照1.2.2方法操作，測(cè)定547 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程得到FOATTA質(zhì)量濃度，按式(1)計(jì)算FOATTA得率(%)[16]：
(1)
式中：c為樣品溶液中總?cè)扑豳|(zhì)量濃度，mg·mL-1；V為樣品溶液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為阿里紅粉末質(zhì)量，g。
1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)
以FOATTA得率作評(píng)價(jià)指標(biāo)，固定提取溫度50 ℃、超聲功率200 W，分別考察料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，g∶mL,下同)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、提取時(shí)間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)對(duì)FOATTA得率的影響，每組實(shí)驗(yàn)平行做3次，結(jié)果取平均值。
1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)
在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)為考察因素，以FOATTA得率為響應(yīng)值，使用Design-Expert 13軟件進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，因素與水平如表1所示。
表1 因素與水平
1.2.7 體外抗氧化活性的測(cè)定
1.2.7.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定
參照文獻(xiàn)[17]，分別取濃度為1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1的樣品溶液各2 mL，加入0.04 mg·mL-1DPPH自由基溶液(用無(wú)水乙醇定容)2 mL，避光反應(yīng)0.5 h，于517 nm處測(cè)定吸光度(A1)；以等體積VC標(biāo)準(zhǔn)溶液(用無(wú)水乙醇定容)為陽(yáng)性對(duì)照，同法操作，測(cè)定吸光度(A2)；以等體積無(wú)水乙醇代替樣品溶液為空白對(duì)照，同法操作，測(cè)定吸光度(A0)。每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率(%)：
(2)
1.2.7.2 Fe3+還原能力的測(cè)定
參照文獻(xiàn)[18]，分別取濃度為1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1的樣品溶液各1 mL，加入pH值為6.6的0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，在50 ℃水浴鍋中加熱反應(yīng)20 min；取出，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，5 000 r·min-1離心10 min，移取上清液2.5 mL于離心管中，分別加入蒸餾水2.5 mL和0.1% 三氯化鐵溶液0.5 mL，混勻，放置10 min后，測(cè)定700 nm處吸光度；以等體積VC標(biāo)準(zhǔn)溶液(用無(wú)水乙醇定容)為陽(yáng)性對(duì)照，同法操作，測(cè)定吸光度，每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。以吸光度表示Fe3+還原能力，吸光度與Fe3+還原能力呈正比。
2 結(jié)果與討論
2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1.1 料液比對(duì)FOATTA得率的影響(圖1)
注：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間20 min
由圖1可知，F(xiàn)OATTA得率隨料液比的減小,即提取溶劑用量的增加,先升高后降低，在料液比為1∶35時(shí)達(dá)到最高。這可能是因?yàn)?，溶劑用量增加可以使溶劑充分接觸藥材粉末，有利于FOATTA從藥材內(nèi)部析出，提高了FOATTA得率;但是溶劑用量過(guò)多則會(huì)引起其它可溶性雜質(zhì)溶出，減少FOATTA的溶出，導(dǎo)致其得率降低[19]。因此，選擇適宜的料液比為1∶35。
2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)FOATTA得率的影響(圖2)
注：料液比1∶35、提取時(shí)間20 min
由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，F(xiàn)OATTA得率先升高后降低，特別是乙醇體積分?jǐn)?shù)從50%增至60%時(shí)，F(xiàn)OATTA得率大幅升高，繼續(xù)增至80%時(shí)，F(xiàn)OATTA得率達(dá)到最高。這可能是因?yàn)?，F(xiàn)OATTA的溶解度會(huì)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，但是乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)，阿里紅中的一些醇溶性物質(zhì)、色素等雜質(zhì)會(huì)部分溶出，使得FOATTA溶解度降低，導(dǎo)致其得率降低，也會(huì)增大溶劑成本[20]。因此，選擇適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。
2.1.3 提取時(shí)間對(duì)FOATTA得率的影響(圖3)
注：料液比1∶35、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%
由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)OATTA得率先升高后降低，在40 min時(shí)達(dá)到最高。這可能是因?yàn)椋崛r(shí)間太短，F(xiàn)OATTA提取不充分；在提取時(shí)間為40 min時(shí)，F(xiàn)OATTA基本溶出；但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，熱效應(yīng)和其它雜質(zhì)的溶出會(huì)使FOATTA得率下降[15]。因此，選擇適宜的提取時(shí)間為40 min。
2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 回歸方程和方差分析
響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。
表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
根據(jù)表2結(jié)果，利用Design-Expert 13軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=14.39-0.3587A+0.4263B+0.3925C+0.1700AB-0.1825AC-0.0325BC-0.4360A2-0.4110B2-0.7835C2。
對(duì)回歸模型進(jìn)一步進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。
表3 回歸模型的方差分析
2.2.2 各因素交互作用分析
為考察兩兩因素對(duì)FOATTA得率的交互影響，對(duì)其作響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖，結(jié)果如圖4所示。
圖4可以直觀(guān)地顯示兩兩因素交互作用對(duì)FOATTA得率的影響，響應(yīng)面坡度越陡，等高線(xiàn)密度越大，則說(shuō)明兩兩因素交互作用較顯著，對(duì)FOATTA得率影響較大。由圖4可知，交互項(xiàng)AC的響應(yīng)面坡度最為陡峭，等高線(xiàn)密度較大呈橢圓，對(duì)FOATTA得率影響較大;交互項(xiàng)AB、BC響應(yīng)面坡度較平緩，等高線(xiàn)密度較稀疏，對(duì)FOATTA得率影響不顯著，這與表3的方差分析結(jié)果一致。
圖4 各因素交互作用對(duì)FOATTA得率影響的響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖Fig.4 Response surface plots and contour plots for effects of interaction between various factors on yield of FOATTA
2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
響應(yīng)面法優(yōu)化的FOATTA的最佳提取工藝為：料液比1∶33.050、乙醇體積分?jǐn)?shù)86.054%、提取時(shí)間41.384 min，F(xiàn)OATTA得率預(yù)測(cè)值為14.579%。根據(jù)實(shí)際情況，將最佳提取工藝調(diào)整為：料液比1∶33、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時(shí)間40 min，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)OATTA得率為14.510%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.48%，進(jìn)一步證明了該模型的可行性。
2.3 不同產(chǎn)地FOATTA得率的對(duì)比
采用最佳工藝提取6個(gè)產(chǎn)地的FOATTA，計(jì)算FOATTA得率，結(jié)果如表4所示。
表4 6個(gè)產(chǎn)地FOATTA得率/%
由表4可知，黑龍江的FOATTA得率最高，云南昆明的FOATTA得率最低。
比較不同產(chǎn)地的FOATTA得率發(fā)現(xiàn)，東北地區(qū)的FOATTA含量明顯高于新疆和云南地區(qū)，這種差異可能與產(chǎn)地的溫度、濕度、光照等環(huán)境因素有關(guān)。黑龍江和吉林地處我國(guó)東北地區(qū)，土地肥沃，地勢(shì)高寒，天然溫差大，山環(huán)水繞的地理優(yōu)勢(shì)有利于潮濕空氣進(jìn)入形成降水，其優(yōu)越的原始森林環(huán)境更適宜阿里紅的生長(zhǎng)，有效成分FOATTA的含量相對(duì)較高。雖然新疆是阿里紅主要種植產(chǎn)地，與東北地區(qū)緯度接近，光照時(shí)間長(zhǎng)，但晝夜溫差不及東北地區(qū)，且氣候干旱，降水量少，其FOATTA含量不及東北地區(qū)。而云南地區(qū)地處低緯度，屬于亞熱帶，四季如春，氣候特點(diǎn)不鮮明，晝夜溫差較小，因此，F(xiàn)OATTA含量不及東北與新疆地區(qū)。
2.4 抗氧化活性分析
2.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定(圖5)
由圖5可知，F(xiàn)OATTA濃度在1.0～3.0 mg·mL-1范圍內(nèi)時(shí)，隨著濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除率呈不斷上升趨勢(shì)；在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，VC對(duì)DPPH自由基的清除率已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，趨勢(shì)平緩。在3.0 mg·mL-1濃度下，黑龍江FOATTA的DPPH自由基清除率最高， 達(dá)到了70.69%，云南昆明FOATTA的DPPH自由基清除率最低，僅為42.82%。6個(gè)產(chǎn)地的FOATTA含量越高，其對(duì)DPPH自由基清除能力越強(qiáng)(表4、圖5)。雖然6個(gè)產(chǎn)地的FOATTA對(duì)DPPH自由基的清除率均低于同濃度VC,但仍然可以說(shuō)明FOATTA具有一定的抗氧化能力。
圖5 6個(gè)產(chǎn)地FOATTA對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.5 Scavenging rates of DPPH free radicals by FOATTAfrom six producing areas
2.4.2 Fe3+還原能力的測(cè)定(圖6)
圖6 6個(gè)產(chǎn)地FOATTA對(duì)Fe3+的還原能力Fig.6 Fe3+ reducing ability of FOATTA from six producing areas
由圖6可知，F(xiàn)OATTA濃度在1.0～3.0 mg·mL-1范圍內(nèi)時(shí)，隨著濃度的增加，其對(duì)Fe3+還原能力呈一定量效關(guān)系；在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，VC的Fe3+還原能力達(dá)到飽和，基本無(wú)變化，明顯高于各個(gè)產(chǎn)地FOATTA的Fe3+還原能力。不同產(chǎn)地的Fe3+還原能力大小為：黑龍江>吉林>新疆伊犁>新疆阿勒泰>云南大理>云南昆明，且不同產(chǎn)地的Fe3+還原能力也與FOATTA含量成正比。雖然各個(gè)產(chǎn)地FOATTA具有一定還原能力，但是整體均弱于VC。
3 結(jié)論
以新疆、黑龍江、吉林、云南等6個(gè)不同產(chǎn)地的阿里紅為研究對(duì)象，采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化FOATTA超聲輔助提取工藝，確定最佳的提取工藝為：料液比1∶33(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時(shí)間40 min，在此條件下，F(xiàn)OATTA得率為14.510%。
比較不同產(chǎn)地的FOATTA得率發(fā)現(xiàn)，黑龍江的FOATTA得率最高，云南昆明的FOATTA得率最低。不同產(chǎn)地的FOATTA含量與其DPPH自由基清除率和Fe3+還原能力呈正比，表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，但整體弱于VC。表明，F(xiàn)OATTA含量受地域、自然環(huán)境、氣候等諸多因素影響，進(jìn)而造成其抗氧化能力的差異。
本實(shí)驗(yàn)得到的FOATTA僅為粗提物，并未進(jìn)行純化，只對(duì)其抗氧化能力作了初步分析，F(xiàn)OATTA成分復(fù)雜，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將對(duì)FOATTA進(jìn)行定性分析、結(jié)構(gòu)分析、純化工藝以及其它生物活性研究，為阿里紅資源的充分利用和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其有效成分提供更多理論支撐。
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(新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017)
阿里紅(FomesofficinalisAmes,FOA),在維語(yǔ)中多被譯為“哈日混”，又稱(chēng)麻西芒，來(lái)源于擔(dān)子菌綱多孔菌科層孔菌屬植物苦白蹄的干燥子實(shí)體，在我國(guó)新疆、云南、四川、吉林、黑龍江等地分布廣泛，也是新疆維吾爾族民間常用藥物[1]。據(jù)《中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書(shū)》記載，其性味干熱微辛，有祛寒止痛、燥濕平喘、利尿通經(jīng)等功效，用于治療寒性感冒、胸痛、關(guān)節(jié)痛、閉尿閉經(jīng)、慢性氣管炎等癥[2]。研究表明，阿里紅富含三萜酸類(lèi)、多糖類(lèi)、倍半萜類(lèi)、脂肪酸類(lèi)等化合物，其中三萜酸類(lèi)化合物是阿里紅發(fā)揮藥效的重要活性成分，具有抗炎抗菌、抗腫瘤、抗氧化、祛痰止咳、鎮(zhèn)痛、降血糖血脂等多種藥理作用[3-6]。
目前，三萜酸類(lèi)化合物的提取方法包括溶劑浸提法、超高壓提取法、機(jī)械化學(xué)提取法、超聲輔助提取法、酶解提取法、微波提取法等[7-10]，其中超聲輔助提取法易于操作、節(jié)省溶劑、提取效率高、對(duì)環(huán)境友好，被廣泛用于植物三萜酸類(lèi)化學(xué)成分的提取。黑棗三萜酸[7]、棗果三萜酸[11]、柿果皮總?cè)扑醄12]等的超聲輔助提取工藝均已被報(bào)道。近年來(lái)，有研究[13-15]顯示三萜酸類(lèi)化合物具有抗氧化作用，可以作為潛在抗氧化劑。目前，關(guān)于阿里紅總?cè)扑?total triterpenoid acids fromFomesofficinalisAmes,FOATTA)的提取及其抗氧化活性的研究報(bào)道較少。鑒于此，作者以黑龍江、新疆、吉林、云南等6個(gè)產(chǎn)地阿里紅為原料，采用超聲輔助法提取FOATTA，以FOATTA得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，比較不同產(chǎn)地FOATTA得率及抗氧化活性的差異，旨在為阿里紅資源的深入開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。
1 實(shí)驗(yàn)
1.1 材料、試劑與儀器
新疆阿勒泰阿里紅(批號(hào)191209)，新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院；新疆伊犁阿里紅(批號(hào)211203)，新疆烏魯木齊維藥藥材市場(chǎng)；黑龍江阿里紅(批號(hào)191008)、吉林阿里紅(批號(hào)191225)、云南昆明阿里紅(批號(hào)191116)、云南大理阿里紅(批號(hào)191218)，亳州億弘堂藥業(yè)有限公司。
齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、VC標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH自由基，純度(HPLC)≥99%，上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵，分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；MAX-C6002型電子天平，深圳無(wú)限量衡器有限公司；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；Sigma-4k15型冷凍離心機(jī)，北京卓明貿(mào)易有限公司；722S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
精密稱(chēng)取干燥至恒重的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg于25 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，得濃度為0.2 mg·mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃下密封保存，備用。
1.2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇[3]
移取1 mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于15 mL具塞試管中，于80 ℃恒溫水浴鍋中至溶劑揮干，然后加入現(xiàn)配的5%香草醛-冰醋酸溶液(稱(chēng)取0.5 g香草醛，用冰醋酸定容至10 mL)0.4 mL和高氯酸溶液1.6 mL，搖勻，于60 ℃恒溫水浴鍋中水浴15 min；取出冷卻后，加入8 mL冰醋酸，搖勻，靜置反應(yīng)10 min,以空白試劑(除標(biāo)準(zhǔn)溶液以外的試劑配制)為參比，在450～650 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其最大吸收峰在547 nm處。因此，選擇測(cè)定波長(zhǎng)為547 nm。
1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
分別移取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于15 mL具塞試管中，按照1.2.2方法測(cè)定547 nm處吸光度。以齊墩果酸質(zhì)量濃度(c，mg·mL-1)作橫坐標(biāo)、吸光度(A)作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，擬合得到線(xiàn)性回歸方程為A=48.929c+0.0027，R2=0.9993。
1.2.4 總?cè)扑岬寐实臏y(cè)定
將干燥的阿里紅用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩。精密稱(chēng)取1.0 g阿里紅粉末，將超聲功率設(shè)定為200 W、提取溫度設(shè)定為50 ℃，在一定的料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間條件下提取FOATTA；抽濾，5 000 r·min-1離心10 min，上清液用相應(yīng)提取溶劑定容；移取1.0 mL適當(dāng)稀釋?zhuān)缓笕?.2 mL樣品溶液于15 mL具塞試管中，按照1.2.2方法操作，測(cè)定547 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程得到FOATTA質(zhì)量濃度，按式(1)計(jì)算FOATTA得率(%)[16]：
(1)
式中：c為樣品溶液中總?cè)扑豳|(zhì)量濃度，mg·mL-1；V為樣品溶液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為阿里紅粉末質(zhì)量，g。
1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)
以FOATTA得率作評(píng)價(jià)指標(biāo)，固定提取溫度50 ℃、超聲功率200 W，分別考察料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，g∶mL,下同)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、提取時(shí)間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)對(duì)FOATTA得率的影響，每組實(shí)驗(yàn)平行做3次，結(jié)果取平均值。
1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)
在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)為考察因素，以FOATTA得率為響應(yīng)值，使用Design-Expert 13軟件進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，因素與水平如表1所示。
表1 因素與水平
1.2.7 體外抗氧化活性的測(cè)定
1.2.7.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定
參照文獻(xiàn)[17]，分別取濃度為1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1的樣品溶液各2 mL，加入0.04 mg·mL-1DPPH自由基溶液(用無(wú)水乙醇定容)2 mL，避光反應(yīng)0.5 h，于517 nm處測(cè)定吸光度(A1)；以等體積VC標(biāo)準(zhǔn)溶液(用無(wú)水乙醇定容)為陽(yáng)性對(duì)照，同法操作，測(cè)定吸光度(A2)；以等體積無(wú)水乙醇代替樣品溶液為空白對(duì)照，同法操作，測(cè)定吸光度(A0)。每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率(%)：
(2)
1.2.7.2 Fe3+還原能力的測(cè)定
參照文獻(xiàn)[18]，分別取濃度為1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1的樣品溶液各1 mL，加入pH值為6.6的0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，在50 ℃水浴鍋中加熱反應(yīng)20 min；取出，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，5 000 r·min-1離心10 min，移取上清液2.5 mL于離心管中，分別加入蒸餾水2.5 mL和0.1% 三氯化鐵溶液0.5 mL，混勻，放置10 min后，測(cè)定700 nm處吸光度；以等體積VC標(biāo)準(zhǔn)溶液(用無(wú)水乙醇定容)為陽(yáng)性對(duì)照，同法操作，測(cè)定吸光度，每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。以吸光度表示Fe3+還原能力，吸光度與Fe3+還原能力呈正比。
2 結(jié)果與討論
2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1.1 料液比對(duì)FOATTA得率的影響(圖1)
注：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間20 min
由圖1可知，F(xiàn)OATTA得率隨料液比的減小,即提取溶劑用量的增加,先升高后降低，在料液比為1∶35時(shí)達(dá)到最高。這可能是因?yàn)?，溶劑用量增加可以使溶劑充分接觸藥材粉末，有利于FOATTA從藥材內(nèi)部析出，提高了FOATTA得率;但是溶劑用量過(guò)多則會(huì)引起其它可溶性雜質(zhì)溶出，減少FOATTA的溶出，導(dǎo)致其得率降低[19]。因此，選擇適宜的料液比為1∶35。
2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)FOATTA得率的影響(圖2)
注：料液比1∶35、提取時(shí)間20 min
由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，F(xiàn)OATTA得率先升高后降低，特別是乙醇體積分?jǐn)?shù)從50%增至60%時(shí)，F(xiàn)OATTA得率大幅升高，繼續(xù)增至80%時(shí)，F(xiàn)OATTA得率達(dá)到最高。這可能是因?yàn)?，F(xiàn)OATTA的溶解度會(huì)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，但是乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)，阿里紅中的一些醇溶性物質(zhì)、色素等雜質(zhì)會(huì)部分溶出，使得FOATTA溶解度降低，導(dǎo)致其得率降低，也會(huì)增大溶劑成本[20]。因此，選擇適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。
2.1.3 提取時(shí)間對(duì)FOATTA得率的影響(圖3)
注：料液比1∶35、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%
由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)OATTA得率先升高后降低，在40 min時(shí)達(dá)到最高。這可能是因?yàn)椋崛r(shí)間太短，F(xiàn)OATTA提取不充分；在提取時(shí)間為40 min時(shí)，F(xiàn)OATTA基本溶出；但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，熱效應(yīng)和其它雜質(zhì)的溶出會(huì)使FOATTA得率下降[15]。因此，選擇適宜的提取時(shí)間為40 min。
2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 回歸方程和方差分析
響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。
表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
根據(jù)表2結(jié)果，利用Design-Expert 13軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=14.39-0.3587A+0.4263B+0.3925C+0.1700AB-0.1825AC-0.0325BC-0.4360A2-0.4110B2-0.7835C2。
對(duì)回歸模型進(jìn)一步進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。
表3 回歸模型的方差分析
2.2.2 各因素交互作用分析
為考察兩兩因素對(duì)FOATTA得率的交互影響，對(duì)其作響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖，結(jié)果如圖4所示。
圖4可以直觀(guān)地顯示兩兩因素交互作用對(duì)FOATTA得率的影響，響應(yīng)面坡度越陡，等高線(xiàn)密度越大，則說(shuō)明兩兩因素交互作用較顯著，對(duì)FOATTA得率影響較大。由圖4可知，交互項(xiàng)AC的響應(yīng)面坡度最為陡峭，等高線(xiàn)密度較大呈橢圓，對(duì)FOATTA得率影響較大;交互項(xiàng)AB、BC響應(yīng)面坡度較平緩，等高線(xiàn)密度較稀疏，對(duì)FOATTA得率影響不顯著，這與表3的方差分析結(jié)果一致。
圖4 各因素交互作用對(duì)FOATTA得率影響的響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖Fig.4 Response surface plots and contour plots for effects of interaction between various factors on yield of FOATTA
2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
響應(yīng)面法優(yōu)化的FOATTA的最佳提取工藝為：料液比1∶33.050、乙醇體積分?jǐn)?shù)86.054%、提取時(shí)間41.384 min，F(xiàn)OATTA得率預(yù)測(cè)值為14.579%。根據(jù)實(shí)際情況，將最佳提取工藝調(diào)整為：料液比1∶33、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時(shí)間40 min，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)OATTA得率為14.510%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.48%，進(jìn)一步證明了該模型的可行性。
2.3 不同產(chǎn)地FOATTA得率的對(duì)比
采用最佳工藝提取6個(gè)產(chǎn)地的FOATTA，計(jì)算FOATTA得率，結(jié)果如表4所示。
表4 6個(gè)產(chǎn)地FOATTA得率/%
由表4可知，黑龍江的FOATTA得率最高，云南昆明的FOATTA得率最低。
比較不同產(chǎn)地的FOATTA得率發(fā)現(xiàn)，東北地區(qū)的FOATTA含量明顯高于新疆和云南地區(qū)，這種差異可能與產(chǎn)地的溫度、濕度、光照等環(huán)境因素有關(guān)。黑龍江和吉林地處我國(guó)東北地區(qū)，土地肥沃，地勢(shì)高寒，天然溫差大，山環(huán)水繞的地理優(yōu)勢(shì)有利于潮濕空氣進(jìn)入形成降水，其優(yōu)越的原始森林環(huán)境更適宜阿里紅的生長(zhǎng)，有效成分FOATTA的含量相對(duì)較高。雖然新疆是阿里紅主要種植產(chǎn)地，與東北地區(qū)緯度接近，光照時(shí)間長(zhǎng)，但晝夜溫差不及東北地區(qū)，且氣候干旱，降水量少，其FOATTA含量不及東北地區(qū)。而云南地區(qū)地處低緯度，屬于亞熱帶，四季如春，氣候特點(diǎn)不鮮明，晝夜溫差較小，因此，F(xiàn)OATTA含量不及東北與新疆地區(qū)。
2.4 抗氧化活性分析
2.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定(圖5)
由圖5可知，F(xiàn)OATTA濃度在1.0～3.0 mg·mL-1范圍內(nèi)時(shí)，隨著濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除率呈不斷上升趨勢(shì)；在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，VC對(duì)DPPH自由基的清除率已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，趨勢(shì)平緩。在3.0 mg·mL-1濃度下，黑龍江FOATTA的DPPH自由基清除率最高， 達(dá)到了70.69%，云南昆明FOATTA的DPPH自由基清除率最低，僅為42.82%。6個(gè)產(chǎn)地的FOATTA含量越高，其對(duì)DPPH自由基清除能力越強(qiáng)(表4、圖5)。雖然6個(gè)產(chǎn)地的FOATTA對(duì)DPPH自由基的清除率均低于同濃度VC,但仍然可以說(shuō)明FOATTA具有一定的抗氧化能力。
圖5 6個(gè)產(chǎn)地FOATTA對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.5 Scavenging rates of DPPH free radicals by FOATTAfrom six producing areas
2.4.2 Fe3+還原能力的測(cè)定(圖6)
圖6 6個(gè)產(chǎn)地FOATTA對(duì)Fe3+的還原能力Fig.6 Fe3+ reducing ability of FOATTA from six producing areas
由圖6可知，F(xiàn)OATTA濃度在1.0～3.0 mg·mL-1范圍內(nèi)時(shí)，隨著濃度的增加，其對(duì)Fe3+還原能力呈一定量效關(guān)系；在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，VC的Fe3+還原能力達(dá)到飽和，基本無(wú)變化，明顯高于各個(gè)產(chǎn)地FOATTA的Fe3+還原能力。不同產(chǎn)地的Fe3+還原能力大小為：黑龍江>吉林>新疆伊犁>新疆阿勒泰>云南大理>云南昆明，且不同產(chǎn)地的Fe3+還原能力也與FOATTA含量成正比。雖然各個(gè)產(chǎn)地FOATTA具有一定還原能力，但是整體均弱于VC。
3 結(jié)論
以新疆、黑龍江、吉林、云南等6個(gè)不同產(chǎn)地的阿里紅為研究對(duì)象，采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化FOATTA超聲輔助提取工藝，確定最佳的提取工藝為：料液比1∶33(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時(shí)間40 min，在此條件下，F(xiàn)OATTA得率為14.510%。
比較不同產(chǎn)地的FOATTA得率發(fā)現(xiàn)，黑龍江的FOATTA得率最高，云南昆明的FOATTA得率最低。不同產(chǎn)地的FOATTA含量與其DPPH自由基清除率和Fe3+還原能力呈正比，表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，但整體弱于VC。表明，F(xiàn)OATTA含量受地域、自然環(huán)境、氣候等諸多因素影響，進(jìn)而造成其抗氧化能力的差異。
本實(shí)驗(yàn)得到的FOATTA僅為粗提物，并未進(jìn)行純化，只對(duì)其抗氧化能力作了初步分析，F(xiàn)OATTA成分復(fù)雜，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將對(duì)FOATTA進(jìn)行定性分析、結(jié)構(gòu)分析、純化工藝以及其它生物活性研究，為阿里紅資源的充分利用和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其有效成分提供更多理論支撐。
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