張?zhí)K霞，晏 堂，樓 麗，劉永靜，褚克丹

（福建中醫(yī)藥大學藥學院 ，福建 福州 350122）

滿山紅為杜鵑花科植物興安杜鵑（Rhododendron dauricumL.）的干燥葉，具有止咳化痰的功效，用于咳嗽氣喘痰多［1］?，F(xiàn)代藥理實驗表明：滿山紅具有止咳、祛痰、平喘、抗炎及抑菌等作用，臨床上可以用于治療慢性氣管炎［2］。滿山紅主要含有黃酮類、生物堿類等成分［3］，其中黃酮類化合物杜鵑素是其發(fā)揮止咳化痰作用的主要有效成分。杜鵑素的水溶性較差，滿山紅中杜鵑素的提取溶劑常為甲醇、乙酸乙酯等有機溶劑，這些傳統(tǒng)有機溶劑具有毒性大、揮發(fā)性強的缺點。2020年版《中華人民共和國藥典》中收載的滿山紅中杜鵑素供試品溶液的制備方法是采用甲醇為提取溶劑［1］，因此，探究環(huán)保的、具有較高提取率的滿山紅中杜鵑素的提取方法對于滿山紅藥材的進一步開發(fā)利用具有重要研究價值。低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）［4］是一種通過不同氫供體（hydrogen-bond donor，HBD）和氫受體（hydrogen-bond acceptor，HBA）混合形成的一種新型綠色溶劑［4］，常用的氫供體有多醇、酰胺類等，氫受體有季銨堿、氨基酸等［5］。DES的制備方法有加熱攪拌法、研磨法、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法和冷凍干燥法［6］。DES具有低熔點、低毒性等理化性質(zhì)［7-8］，不僅制備方式簡單，價格低廉，還具有環(huán)境友好、穩(wěn)定等優(yōu)勢［4］，更符合目前對綠色化學的要求，因此被廣泛地應(yīng)用于中藥提取領(lǐng)域［9］。

本研究通過加熱攪拌制備不同種類的低共熔溶劑作為提取溶劑，篩選最優(yōu)低共溶溶劑，優(yōu)化其料液比、含水量和提取時間，考察對滿山紅中杜鵑素提取率的影響，為進一步開發(fā)滿山紅資源和拓寬低共熔溶劑在中草藥綠色提取方法提供數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2030高效液相色譜儀（日本島津公司）；搖擺式高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司，型號：DFY-500）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，型號：XS105）；超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-500E）；恒溫磁力攪拌器（常州國華電器有限公司，型號：85-2）。

1.2 試藥 氯化膽堿（分析純）、甜菜堿（分析純）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二醇（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；1，2-丙二醇、丙三醇、1，4-丁二醇、尿素、乙酰胺等其他試劑均為分析純，甲醇為色譜純，均購自國藥集團化學試劑有限公司；杜鵑素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：PS010614，純度≥99.0%）；滿山紅藥材（亳州市滬譙藥業(yè)有限公司），經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院黃澤豪教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 低共熔溶劑的制備 分別以氯化膽堿和甜菜堿為HBA，以不同種類的有機醇和有機胺類化合物為HBD，摩爾比為1∶2，稱取不同質(zhì)量的HBA和HBD混合放置于錐形瓶中，采用磁力攪拌器在80 ℃左右加熱攪拌成均一穩(wěn)定的溶液狀，得到7種不同種類的DES，見表1。

表1 7種DES的制備

2.2 色譜條件 色譜柱：AcclaimTM120 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（60∶40），等度洗脫；檢測波長：295 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取杜鵑素對照品10.08 mg置10 mL容量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到對照品儲備液。精密吸取杜鵑素對照品儲備液0.2 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為21.60 μg/mL的杜鵑素對照品溶液。

2.4 DES提取條件的優(yōu)化

2.4.1 杜鵑素提取液的提取 取滿山紅藥材粉碎，過60目篩，得到滿山紅粗粉；精密稱取粗粉0.3 g，置錐形瓶中，分別精密加入“2.1”項下制備的7種DES各7 mL后加入蒸餾水3 mL，在功率500 W、頻率40 kHz的條件下超聲處理30 min，放置室溫；精密吸取上清液1.0 mL到量瓶中，加水稀釋至4.0 mL，混勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得到7種杜鵑素提取液。

2.4.2 DES最佳種類的篩選 將“2.4.1”項下制備所得的7種杜鵑素提取液，按“2.2”項下色譜方法對滿山紅中杜鵑素進行含量測定，以滿山紅中杜鵑素提取率為指標篩選最佳DES，結(jié)果見圖1。

圖1 7種DES對滿山紅中杜鵑素提取率的影響

注：C為杜鵑素提取液濃度；V為提取液體積；D為稀釋倍數(shù)；M為滿山紅稱樣量。

由圖1可知：DES 6作為提取溶劑時杜鵑素提取率最高，但溶劑黏度較高，操作過程具有一定的難度，因此，選擇杜鵑素提取率僅次于DES 6的DES 3作為提取溶劑，進行后續(xù)研究。

2.4.3 HBA/HBD摩爾比優(yōu)化 有研究顯示：組分的不同比例會直接影響DES的物理化學性質(zhì)，如黏度、極性、表面張力等，從而影響提取效果［10］。故分別制備摩爾比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的氯化膽堿/1，2-丙二醇DES，按“2.4.1”項下分別對杜鵑素進行提取，考察其對杜鵑素提取率的影響，結(jié)果見圖2A。由圖2A可知：氯化膽堿/1，2丙二醇的摩爾比為1∶4時杜鵑素提取率達到最大值，繼續(xù)增加1，2丙二醇的摩爾比，提取率反而降低。造成這種現(xiàn)象的原因可能是增加1，2丙二醇含量可降低DES的黏度和表面張力，從而增加杜鵑素的擴散［11］，從而降低提取效率。但是HBD質(zhì)量太低會導致目標組分與DES的相互作用減弱，因此，最終選擇最佳摩爾比為1∶4。

2.4.4 DES含水量優(yōu)化 以不同含水量（0%、10%、20%、30%、40%）考察其對杜鵑素提取率的影響，結(jié)果見圖2B。由圖2B可知：杜鵑素提取率隨著DES含水量的增加呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢，當DES含水量為10%時，杜鵑素提取率最高，而繼續(xù)增加含水量，杜鵑素提取率反而降低。分析其原因：一方面，水的加入可以降低DES的黏度，提高DES在滿山紅藥材中的擴散能力，從而導致提取率增加；另一方面，杜鵑素易溶于甲醇、乙酸乙酯等非極性有機溶劑，水的加入增大了DES的極性，根據(jù)溶劑的“相似相溶”原則，含水量增加過多反而不利于杜鵑素的提取。因此，當DES含水量達到10%以后繼續(xù)增加時，提取率反而降低，因此，最終選擇DES的含水量為10%。

2.4.5 料液比優(yōu)化 以不同料液比（1∶20、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200）考察其對杜鵑素提取率的影響，結(jié)果見圖2C。由圖2C可知：當料液比為1∶150時，杜鵑素提取率達到最佳，料液比增加到1∶200時，杜鵑素提取率反而降低。這是由于DES本身具有一定的黏度，在一定的范圍內(nèi)，增加提取溶劑用量可以增大其與滿山紅藥材的接觸面積，有利于溶質(zhì)之間的擴散，故提取率增大。但是如果超過了這個范圍，繼續(xù)擴大溶劑用量而藥材占比降低，則提取率降低，因此最終選擇料液比為1∶150。

2.4.6 超聲時間優(yōu)化 以不同超聲提取時間（15、30、45 min）考察其對杜鵑素提取率的影響，結(jié)果見圖2D。由圖2D可知：杜鵑素提取率隨超聲提取時間的增加呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢，當超聲時間為30 min時提取率最高，超聲提取時間增加至45 min時，提取率顯著下降。推測是由于過長的超聲提取時間使儀器溫度升高，從而會破壞滿山紅中杜鵑素的分子結(jié)構(gòu)，因此，最終選擇超聲時間為30 min。

圖2 DES提取條件優(yōu)化

2.4.7 試驗驗證 綜上所述，滿山紅中杜鵑素提取的DES最佳配制法為：氯化膽堿/1，2-丙二醇摩爾比為1∶4、含水量為10%、料液比為1∶150、超聲時間30 min。為了驗證上述試驗得到的結(jié)果是否可靠，按上述實驗條件配置DES，平行取三批滿山紅藥材，提取得到杜鵑素提取液，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，計算提取率。

結(jié)果表明：優(yōu)化后的滿山紅中杜鵑素的DES配制工藝穩(wěn)定可行，具有一定的參考價值。實驗結(jié)果見表2。

表2 DES最佳配制工藝試驗驗證結(jié)果

2.4.8 供試品溶液的制備 按“2.4.7”項下提取得到杜鵑素供試品溶液。

2.5 線性關(guān)系的考察 精密吸取“2.3”項下杜鵑素對照品溶液0.5、1、2、5、10 μL，按“2.2”項下色譜條件進行測定，以進樣量（X）為橫坐標，峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸分析，繪制標準曲線，得到杜鵑素的回歸方程：Y＝3×106X－467.5（r=1.000），結(jié)果表明杜鵑素在0.0108～0.432 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 專屬性試驗 精密吸取“2.3”項下杜鵑素對照品溶液、“2.1”項下氯化膽堿/1，2-丙二醇（1∶4）各 10 μL，按“2.2”項下色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄各溶液色譜圖。結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示氯化膽堿/1，2-丙二醇（1∶4）空白溶劑在對照品色譜峰相應(yīng)位置處未見色譜峰，方法專屬性良好。

圖3 HPLC色譜圖

2.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.4.8”項下制備的杜鵑素供試品溶液，分別在0、2、4、8 h內(nèi)進樣，按“2.2”項下色譜條件測定，記錄杜鵑素的峰面積。結(jié)果表明杜鵑素色譜峰的峰面積RSD為1.67%，說明供試品在 8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 精密度試驗 精密吸取同一份杜鵑素對照品溶液（濃度為21.60 μg/mL） 10 μL，連續(xù)注入高效液相色譜儀5次，計算杜鵑素對照品的峰面積RSD。結(jié)果表明RSD小于2.0%，說明儀器精密度良好。

2.9 重復性試驗 取同一批滿山紅粗粉，按“2.4.8”項下方法分別制備6份杜鵑素供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件注入高效液相色譜儀并計算杜鵑素提取率。結(jié)果顯示杜鵑素平均含量為0.951 mg/g，RSD為1.40%，說明DES提取滿山紅中的杜鵑素的方法重復性良好。

2.10 加樣回收試驗 取同一批滿山紅藥材粗粉約0.03 g，精密稱定6份，分別精密加入杜鵑素對照品適量，按“2.4.8”項下方法制備杜鵑素供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件注入高效液相色譜儀，測定杜鵑素的峰面積，計算回收率和平均回收率，結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明此方法準確度良好。

表3 加樣回收率實驗結(jié)果

2.11 DES與傳統(tǒng)提取溶劑對杜鵑素提取率的比較 按《中華人民共和國藥典》［1］的提取方法，得到甲醇溶劑對杜鵑素的提取率為0.500 mg/g，而低共熔溶劑氯化膽堿/1，2丙二醇對杜鵑素的提取率為0.951 mg/g，較傳統(tǒng)溶劑甲醇提高了90%。

因此，DES提取滿山紅中杜鵑素的提取率高于傳統(tǒng)溶劑甲醇的提取，且甲醇存在易揮發(fā)、毒性較大、污染環(huán)境等缺點，難以滿足綠色化學的需求。另外，根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》［1］記載，用甲醇提取杜鵑素之后又經(jīng)過了濃縮過程，而本法不僅提取率較高，無需濃縮，且其他操作也更為簡便。

3 討 論

本實驗以DES為提取溶劑提取滿山紅中的杜鵑素，建立杜鵑素含量測定的提取方法，通過對含水量、料液比、超聲時間單因素考察得到最佳的低共熔溶劑配制方法為：DES組分為氯化膽堿/1，2-丙二醇，摩爾比為1∶4，含水量為10%，料液比為1∶150，超聲時間為30 min。在此最優(yōu)的條件下得到杜鵑素提取率為0.951 mg/g，與甲醇為提取溶劑時的提取率相比，DES明顯優(yōu)于甲醇，說明DES對滿山紅中杜鵑素提取率的提高具有一定的優(yōu)勢。除此之外，DES是一種新型綠色溶劑，具有低毒性、易合成等優(yōu)點，有望替代傳統(tǒng)溶劑對滿山紅中杜鵑素進行提取。