何 偉，陳迎麗，魏 杰，陳貴廷

(貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴陽(yáng)550002)

吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)是一種高效廣譜的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其通過抑制病原菌細(xì)胞的線粒體呼吸，阻止細(xì)胞色素bc1復(fù)合體電子傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致細(xì)胞缺少代謝能量而死亡，具有保護(hù)、治療、增效和傳導(dǎo)等作用[1-2]，對(duì)多種植物的真菌性病害具有很好的防治效果[3-6]。氰霜唑(cyazofamid)是一種保護(hù)性殺菌劑，發(fā)現(xiàn)于1987年，2001年首次在英國(guó)登記，同年在日本和韓國(guó)登記，主要應(yīng)用于水稻、小麥、黃瓜、馬鈴薯等作物的病害防治，可有效防治水稻立枯病、黃瓜霜霉病、小麥白粉病、馬鈴薯晚疫病等真菌性病害[7-10]。

吡唑醚菌酯和氰霜唑在病害方面的良好防治效果，使其成為市場(chǎng)上需求比較旺盛的殺菌劑。根據(jù)農(nóng)藥信息網(wǎng)農(nóng)藥登記信息，除原藥外，吡唑醚菌酯和氰霜唑在登記有效期內(nèi)的產(chǎn)品分別有643個(gè)和128個(gè)，主要登記用于果樹、蔬菜、觀賞植物和大田作物。隨著吡唑醚菌酯和氰霜唑的大面積應(yīng)用，因缺少安全合理使用的參考依據(jù)，造成過量使用和濫用，對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了一定程度的不利影響。因此，為了預(yù)防農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不利影響，開展農(nóng)藥生態(tài)環(huán)境毒理試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其對(duì)生態(tài)環(huán)境的安全性，對(duì)農(nóng)藥的安全合理使用和避免造成生態(tài)環(huán)境損害具有重要作用。目前，吡唑醚菌酯的生態(tài)毒性已有相關(guān)報(bào)道[11]，但氰霜唑單劑以及和吡唑醚菌酯混劑的生態(tài)毒性尚未見報(bào)道，本試驗(yàn)以大型溞、羊角月牙藻和斑馬魚為水生代表生物，根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[12-14]要求，測(cè)定36%吡唑·氰霜唑懸浮劑對(duì)溞類、藻類和魚類的急性毒性效應(yīng)，為農(nóng)藥安全合理使用和生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試生物

大型溞(Daphnia magnaStraus)：購(gòu)自武漢科樂多生物科技有限公司，于溫度18~22℃、光暗比為16 h∶8 h、光照強(qiáng)度1 000~1 500 lx條件下培養(yǎng)，每日以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的純種小球藻喂養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)繁殖3代以上，試驗(yàn)選用來源于同一母系的出生24 h內(nèi)的非頭胎健康溞。

羊角月牙藻(Pseudokirchneriella subcapitata)：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)，于溫度21~24℃、光照強(qiáng)度4 440~8 880 lx條件下，選擇BG11培養(yǎng)基連續(xù)光照培養(yǎng)，每隔96 h接種1次，反復(fù)接種3次以上，使藻處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段。

斑馬魚(Brachydanio rerio)：購(gòu)自上海宏業(yè)觀賞魚養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)19.31~23.97 mm，體質(zhì)量0.16~0.21 g，健康無病，在實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)12 d以上，臨試驗(yàn)前隨機(jī)撈取200尾斑馬魚在與試驗(yàn)相同的環(huán)境條件下馴養(yǎng)7 d，馴養(yǎng)期間每日投食一次紅線蟲，并及時(shí)清除糞便和食物殘?jiān)囼?yàn)前24 h停止喂食，每日光照12~16 h，期間水溫控制在21~25℃，馴養(yǎng)期間供試魚死亡率為0。

1.2 供試藥劑

36%吡唑·氰霜唑懸浮劑(28%吡唑醚菌酯+8%氰霜唑)，江蘇耘農(nóng)化工有限公司。

1.3 主要儀器

液質(zhì)聯(lián)用儀：Agilent 1260-6460C LC-MS/MS，具有AJS ESI離子源；色譜柱：Agilent ZOBAX SB-C18(50 mm×2.1 mm，3.5 μm)(美國(guó)安捷倫科技有限公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)

按照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第13部分：溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)》[12]的要求，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)以及穩(wěn)定性結(jié)果，試驗(yàn)采用靜態(tài)法避光進(jìn)行，設(shè)置質(zhì)量濃度梯度為0.010、0.014、0.020、0.027、0.038 mg a.i./L的試驗(yàn)藥液進(jìn)行正式試驗(yàn)，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，設(shè)置空白對(duì)照，試驗(yàn)藥液體積50 mL，每個(gè)重復(fù)5只溞，試驗(yàn)期間不喂食。試驗(yàn)開始后于0、24、48 h觀察并記錄大型溞受抑制的情況，于0、48 h測(cè)定試驗(yàn)藥液溫度、溶解氧、pH以及各有效成分質(zhì)量濃度。

1.4.2 藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

按照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第14部分：藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)》[13]的要求，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置質(zhì)量濃度梯度為0.038、0.060、0.096、0.154、0.246、0.394、0.630、1.000 mg a.i./L的試驗(yàn)藥液進(jìn)行正式試驗(yàn)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的羊角月牙藻，用BG11培養(yǎng)基配制成藻濃度為4.0×107個(gè)/L的藻溶液，取質(zhì)量濃度為設(shè)置質(zhì)量濃度2倍的試驗(yàn)藥液50 mL與50 mL藻溶液混勻，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，設(shè)置空白對(duì)照。于24、48、72 h取樣在顯微鏡下觀察并記錄羊角月芽藻的生長(zhǎng)情況，并于0、72 h測(cè)定試驗(yàn)溶液的pH、試驗(yàn)環(huán)境光照強(qiáng)度以及試驗(yàn)藥液各有效成分質(zhì)量濃度。

1.4.3 魚類急性毒性試驗(yàn)

按照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第12部分：魚類急性毒性試驗(yàn)》[14]的要求，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)以及穩(wěn)定性結(jié)果，試驗(yàn)采用靜態(tài)法避光進(jìn)行，設(shè)置質(zhì)量濃度梯度為0.059、0.068、0.078、0.090、0.104、0.120 mg a.i./L的試驗(yàn)藥液進(jìn)行正式試驗(yàn)。不設(shè)重復(fù)，設(shè)置空白對(duì)照，試驗(yàn)溶液體積為3 L，按從低到高的濃度順序，撈取10尾魚放入各試驗(yàn)藥液中，供試魚的大小保持一致，試驗(yàn)期間不給食。于0、1、2、3、6、24、48、72、96 h觀察并記錄供試魚的中毒癥狀及死亡數(shù)，及時(shí)清除死魚，每天測(cè)定并記錄試驗(yàn)藥液溫度、pH及溶解氧，于0、96 h測(cè)定試驗(yàn)藥液各有效成分質(zhì)量濃度。

1.5 真實(shí)濃度檢測(cè)

分別于試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)測(cè)定各試驗(yàn)藥液有效成分質(zhì)量濃度，確定溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)和魚類急性毒性試驗(yàn)周期內(nèi)各有效成分質(zhì)量濃度是否為初始實(shí)測(cè)濃度的80%~120%，以保證試驗(yàn)方法的有效性。儀器條件如下：

⑴液相條件：柱溫35℃，流動(dòng)相(甲醇-0.1%甲酸水體積比75∶25)，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量3 μL。

⑵質(zhì)譜條件：離子源AJS ESI(+)，干燥氣N2，流速5 L/min，溫度250℃，鞘氣N2，流速11 L/min，溫度250℃，壓力45 psi，噴嘴電壓500 V，毛細(xì)管電壓3 500 V，掃描模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。離子監(jiān)測(cè)條件見表1。

表1 離子監(jiān)測(cè)條件

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel計(jì)算各試驗(yàn)實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，以2次實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的幾何平均值作為計(jì)算毒性試驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量濃度值，根據(jù)試驗(yàn)期間斑馬魚的死亡率、大型溞的受抑制率以及羊角月牙藻的抑制百分率，采用SPSS 26計(jì)算36%吡唑·氰霜唑懸浮劑對(duì)斑馬魚、大型溞和羊角月牙藻的毒力回歸方程、LC50(或EC50)及95%置信限。

1.7 毒性等級(jí)劃分

根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[12-14]資料性附錄中的毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，按溞類的半效應(yīng)濃度48 h-EC50、藻類的半效應(yīng)濃度72 h-EC50和魚類半效應(yīng)濃度96 h-LC50，將農(nóng)藥對(duì)溞類和魚類的毒性等級(jí)劃分為4個(gè)等級(jí)，對(duì)藻類的毒性等級(jí)劃分為3個(gè)等級(jí)，見表2。

表2 農(nóng)藥對(duì)溞類、藻類和魚類的毒性等級(jí)劃分

2 結(jié)果與分析

2.1 參比試驗(yàn)

為評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果的有效性，以重鉻酸鉀作為參比物，對(duì)大型溞、羊角月牙藻和斑馬魚進(jìn)行參比試驗(yàn)。試驗(yàn)所用大型溞和羊角月牙藻為實(shí)驗(yàn)室自行培養(yǎng)，因此每3個(gè)月定期做一次參比試驗(yàn)；斑馬魚為外購(gòu)，所以每一批斑馬魚均需在本實(shí)驗(yàn)室做參比試驗(yàn)。大型溞最近一次參比試驗(yàn)結(jié)果24 h-EC50為1.104 mg/L，95%置信限為0.984~1.250 mg/L；羊角月牙藻最近一次參比試驗(yàn)72 h-EC50為1.039 mg/L，95%置信限為0.822~1.328 mg/L；試驗(yàn)所用批次斑馬魚參比試驗(yàn)24 h-LC50為213.657 mg/L，95%置信限為180.578~252.523 mg/L。

2.2 實(shí)測(cè)濃度

實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度結(jié)果表明，溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)和魚類急性毒性試驗(yàn)在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，各有效成分質(zhì)量濃度均為初始實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的80%~120%；藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，僅有吡唑醚菌酯質(zhì)量濃度為初始實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的80%~120%，而氰霜唑質(zhì)量濃度為初始實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的31.92%~38.37%，但總體實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度仍為初始實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的80%~120%，說明試驗(yàn)滿足標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控要求。

圖1 36%吡唑·氰霜唑懸浮劑對(duì)3種水生生物急性毒性試驗(yàn)的實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度

2.3 36%吡唑·氰霜唑懸浮劑對(duì)大型溞的急性毒性效應(yīng)

試驗(yàn)周期內(nèi)，試驗(yàn)溶液pH、溶解氧和溫度分別為7.64~8.68、7.08~7.72 mg/L和19.7~20.7℃，處理組大型溞出現(xiàn)游泳緩慢、體色改變、觸角腫大以及輕晃試驗(yàn)容器15 s內(nèi)不能游動(dòng)等中毒癥狀，對(duì)照組大型溞無明顯中毒癥狀，且死亡率為0。半效應(yīng)濃度EC50(48 h)為0.023 mg a.i./L，95%置信限為0.020~0.027 mg a.i./L。根據(jù)毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，36%吡唑·氰霜唑懸浮劑對(duì)大型溞的急性毒性等級(jí)為劇毒。

表3 36%吡唑·氰霜唑懸浮劑對(duì)大型溞的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 36%吡唑·氰霜唑懸浮劑對(duì)羊角月牙藻的急性毒性效應(yīng)

試驗(yàn)周期內(nèi)，對(duì)照組藻細(xì)胞濃度增長(zhǎng)倍數(shù)為134倍，藻細(xì)胞生長(zhǎng)率抑制百分率為3.4%~82.5%，處理組中藻細(xì)胞出現(xiàn)異形和細(xì)胞變小的中毒癥狀，對(duì)照組藻細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)正常。半效應(yīng)濃度EC50(72 h)為0.068 mg a.i./L，95%置信限為0.047~0.089 mg a.i./L。根據(jù)毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，36%吡唑·氰霜唑懸浮劑對(duì)羊角月牙藻的毒性等級(jí)為高毒。

表4 36%吡唑·氰霜唑懸浮劑對(duì)羊角月牙藻的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 36%吡唑·氰霜唑懸浮劑對(duì)斑馬魚的急性毒性效應(yīng)

試驗(yàn)周期內(nèi)，試驗(yàn)溶液pH、溶解氧和溫度分別為7.90~8.35，67.8%~101.1%和23.8~24.1℃，處理組斑馬魚出現(xiàn)正面或側(cè)面平躺、游動(dòng)時(shí)側(cè)翻、異?？焖儆蝿?dòng)、抽搐等中毒癥狀，對(duì)照組斑馬魚無明顯中毒癥狀，且死亡率為0。半效應(yīng)濃度LC50(96 h)為0.088 mg a.i./L，95%置信限為0.083~0.094 mg a.i./L，根據(jù)毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，36%吡唑·氰霜唑懸浮劑對(duì)斑馬魚的毒性等級(jí)為劇毒。

表5 36%吡唑·氰霜唑懸浮劑對(duì)斑馬魚的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

大型溞、藻類和斑馬魚作為水生態(tài)系統(tǒng)中的初級(jí)消費(fèi)者、初級(jí)生產(chǎn)者和次級(jí)消費(fèi)者，常被推薦為生態(tài)毒理評(píng)價(jià)的指示生物。本試驗(yàn)研究中，溞類和魚類試驗(yàn)采用靜態(tài)法避光進(jìn)行，根據(jù)質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果表明，溞類和魚類試驗(yàn)溶液有效成分實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度不低于初始實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的80%，并且實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度處于理論濃度的±20%，說明在避光條件下，供試物有效成分在試驗(yàn)周期內(nèi)能夠保持穩(wěn)定，濃度測(cè)定方法有效可行，試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算時(shí)既可使用理論濃度，也可使用實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度；藻類試驗(yàn)實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度表明，吡唑醚菌酯在試驗(yàn)周期內(nèi)能夠保持穩(wěn)定，氰霜唑?qū)崪y(cè)質(zhì)量濃度不足初始實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的40%，由于氰霜唑占比較低，初始實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度和結(jié)束時(shí)實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的幾何平均值為理論濃度的80%左右，計(jì)算結(jié)果時(shí)采用實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度作為計(jì)算依據(jù)。

本試驗(yàn)證實(shí)，36%吡唑·氰霜唑懸浮劑對(duì)溞類、藻類和魚類的急性毒性等級(jí)分別為劇毒、高毒和劇毒。因此，施藥時(shí)應(yīng)禁止直接施用于水體環(huán)境中，并嚴(yán)禁在水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)、河塘等水體附近使用，防止飄移和淋溶等作用，對(duì)周邊水體環(huán)境造成影響；禁止將施藥器具在河塘等水體環(huán)境中進(jìn)行清洗，導(dǎo)致藥物進(jìn)入水體環(huán)境，引起水環(huán)境中生物死亡，破壞生態(tài)系統(tǒng)，造成生態(tài)環(huán)境受損。