張 偉， 韓祎陟， 羅云敬*， 鄒明強

(1.北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部，環(huán)境與病毒腫瘤學北京市重點實驗室，北京100124;2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123;3.呼和浩特國際旅行衛(wèi)生保健中心，呼和浩特 010020)

迷迭香酸(Rosmarinic Acid,RosA)作為一種水溶性的天然酚酸類抗氧化劑，廣泛存在于迷迭香、紫蘇、薄荷等天然植物中，在保健品、食品和化妝品等領(lǐng)域中具有重要的實用價值。分離提取迷迭香酸的傳統(tǒng)方法包括溶劑浸提法[5,6]、超臨界萃取[7]、生物酶解[8 - 11]和大孔樹脂吸附法[12,13]等。然而，這些方法的提取產(chǎn)物往往存在多酚類衍生物和蛋白等干擾物[5]，特異性差且效率低。因此，開發(fā)一種具有選擇性和實用性的迷迭香酸提取分離方法十分重要。

采用磁性分子印跡技術(shù)在鐵、鈷、鎳等支撐材料表面合成分子印跡聚合物，生成磁性分子印跡聚合物(Magnetic Molecularly Imprinted Polymers,MMIPs)[11,14,15]。它同時兼具特異性和超順磁性，在外加磁場的作用下，可以快速實現(xiàn)復雜基質(zhì)中目標物的提取和分離，極大提高了傳統(tǒng)分子印跡的吸附性能和分離效率[16,17]。目前，磁性分子印跡技術(shù)應用于食品安全[18,19]、藥物分析[20,21]和環(huán)境保護[22]等領(lǐng)域。采用磁性分子印跡法提取分離迷迭香酸的研究未見報道，故本文以迷迭香酸為模板，丙烯酰胺(AM)為功能單體，偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯(lián)劑，以乙烯基修飾的Fe3O4納米粒子為核，合成了迷迭香酸磁性分子印跡聚合物(R-MMIPs)，對其結(jié)構(gòu)和性能進行表征和吸附實驗，結(jié)合高效液相色譜法實現(xiàn)對實際樣品中迷迭香酸的分離和測定。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

高效液相色譜儀(Waters e2695 HPLC-DAD),紅外光譜儀(Nicolet 6700,美國ThermoFisher),高分辨透射電子顯微鏡(Tecnai G2 F30,美國FEI公司),場發(fā)射掃描電子顯微鏡(S-4800,日立公司),振動樣品磁強計(MPMS-3,美國Quantum Desig公司),脫色搖床(TS-A,晶玻實驗儀器廠),頂置式攪拌器(TS-20,上海安譜科技股份有限公司),數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DB,昆山市超聲儀器有限公司)。

迷迭香酸(RosA)、丙烯酰胺(AM)、FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O、桑黃素(Morin)、辣椒堿(Capsaicin)、正硅酸乙酯(TEOS)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)購于北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司;甲基丙烯酸(MAA)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、偶氮二異丁腈(AIBN)、硅烷偶聯(lián)劑KH570(MPS)購于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;NH3·H2O(25%)、甲酸、冰乙酸、甲醇、乙醇購于福晨(天津)化學試劑有限公司。

1.2 迷迭香酸磁性分子印跡聚合物的制備

1.2.1 Fe3O4磁性納米顆粒的制備使用化學共沉淀法制備Fe3O4納米顆粒。將2.36 g FeCl3·6H2O和0.86 g FeCl2·4H2O溶于50 mL去離子水中，充分攪拌。隨后緩慢加入5 mL NH3·H2O,70 ℃持續(xù)攪拌1 h。上述反應過程均在N2保護下進行。冷卻至室溫后用外磁場進行收集分離,用去離子水反復清洗至中性，50 ℃真空干燥24 h。

1.2.2 乙烯基修飾Fe3O4磁性納米顆粒的制備采用溶膠-凝膠法在Fe3O4顆粒表面修飾SiO2。將500 mg Fe3O4納米顆粒分散于100 mL乙醇/水混合液中，超聲分散20 min。然后，在N2保護下依次加入8 mL NH3·H2O和4 mL TEOS。室溫下攪拌反應8 h。通過外磁場分離產(chǎn)物，用乙醇和超純水徹底清洗5次后，向瓶中加入100 mL乙醇，超聲分散20 min。然后，在N2保護下緩慢加入6 mL MPS，40 ℃下攪拌反應12 h，反應產(chǎn)物經(jīng)外磁場分離，并用乙醇和超純水多次洗滌。最后，將產(chǎn)物在50°C真空干燥24 h。

1.2.3 迷迭香酸磁性分子印跡聚合物的制備將0.3 mmol迷迭香酸和1.8 mmol丙烯酰胺溶于40 mL乙醇中,置于4 ℃冰箱里靜置12 h預聚合。然后加入200 mg乙烯基改性的Fe3O4@SiO2,在氮氣保護下充分攪拌30 min。隨后加入30 mmol EGDMA 和0.5 mmol AIBN,超聲20 min后溫置于60 ℃的攪拌器上反應24 h，全程N2保護。反應完成后,使用強磁鐵分離聚合物，然后用甲醇∶乙酸(體積比9∶1)混合溶液索氏提取24 h，直至紫外分光光度計檢測不到溶液中的迷迭香酸為止。最后用乙醇和純水徹底清洗聚合物，并放入烘箱干燥。磁性非分子印跡聚合物(Magnetic Non-molecularly Imprinted Polymers,MNIPs)的制備與 MMIPs相同，但不加入迷迭香酸。

1.3 MMIPs和MNIPs的性能實驗

1.3.1 MMIPs和MNIPs的吸附容量實驗分別稱取15 mg MMIPs和MNIPs置于5 mL梯度濃度(0～30 mg/L)的迷迭香酸乙醇溶液中。在室溫下，振蕩40 min后,用強磁鐵分離聚合物。用紫外分光光度儀測定上清液中迷迭香酸的濃度。分別計算MMIP和MNIP對迷迭香酸的吸附容量Q，并繪制靜態(tài)吸附等溫線。

分別稱取15 mg MMIPs和MNIPs置于5 mL迷迭香酸乙醇溶液(24 mg/L)中。室溫下，振蕩不同時間(0～80 min)。然后用強磁鐵分離聚合物。用紫外分光光度儀測定上清液中迷迭香酸的濃度。分別計算MMIP和MNIP對迷迭香酸的吸附容量Q，并繪制吸附動力學曲線。

1.3.2 MMIPs和MNIPs的選擇性實驗選取迷迭香酸及其結(jié)構(gòu)類似物桑黃素、辣椒堿用于選擇性實驗，通過比較聚合物對3種物質(zhì)的吸附容量來對比其選擇性。將15 mg MMIPs和MNIPs分別加入到盛有5 mL(30 mg/L)混合溶液的試管中。在室溫下振蕩40 min后,用強磁鐵分離聚合物。取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用3 mL甲醇復溶待測。結(jié)合HPLC法測定濃縮液中迷迭香酸和結(jié)構(gòu)類似物的含量。按照上述方法測定MMIPs、MNIPs對不同物質(zhì)的吸附容量，計算出分離因子(α)和印跡印子(β)，考察兩種聚合物的吸附選擇性。

1.4 MMIPs的穩(wěn)定性實驗

準確量取5 mL迷迭香酸標準溶液(30 mg/L)加入到盛有25 mg MMIP或MNIPs的試管中。室溫下，振蕩40 min后用強磁鐵分離聚合物。結(jié)合HPLC-DAD測定上清液中的迷迭香酸含量，同時用甲醇∶乙酸混合溶液、純水清洗聚合物。反復循環(huán)10次，評價其穩(wěn)定性。

1.5 色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相A：甲醇，B：質(zhì)量分數(shù)0.1%的甲酸水溶液；等度洗脫：比例A∶B=60∶40；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：280 nm和330 nm。

1.6 MMIPs在實際樣品中的應用

從當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場購買紫蘇和紫甘藍。分別準確稱量10 g樣品，充分干燥后破碎，加入60 mL 95%乙醇。300 W超聲提取15 min，隨后在70 ℃下回流提取2 h,過濾去渣,濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用乙醇復溶至25 mL備用[23 - 25]。將30 mg MMIPs和MNIPs加入到5 mL上述提取溶液中，在室溫下在振蕩40 min后，使用磁鐵分離，吸取3 mL上清液待測。將標液和上清液分別通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，并使用甲醇復溶。經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后HPLC-DAD測定，重復3次，計算平均檢出量、平均加標回收率和相對標準偏差(RSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同功能單體對聚合物吸附容量的影響

在相同實驗條件下，分別選取丙烯酰胺、甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶按照1.2.3節(jié)合成普通分子印跡聚合物，只是不加入磁性材料，分別考察功能單體種類和比例對聚合物吸附容量的影響。其結(jié)果如表1所示，以甲基丙烯酸為功能單體合成的聚合物吸附量明顯低于其他聚合物，這可能是由于堿性功能單體與迷迭香酸更易形成穩(wěn)定復合物，從而生成更多識別位點。在1∶4、1∶6和1∶8三個水平下，分別合成聚合物，可以看出，當模板分子與功能單體比例為1∶6時，該聚合物的吸附容量高于另外兩個水平。因此選擇丙烯酰胺為功能單體，與模板分子摩爾比為1∶6時合成聚合物。

表1 功能單體對吸附容量(Q)的影響

圖1 MMIPs的SEM(A)、TEM(B)、紅外光譜圖(C)和磁滯曲線(D)Fig.1 SEM(A),TEM(B),infrared spectra(C)and hysteresis regression lines(D) of MMIPs

2.2 表征

2.2.1 MMIPs電鏡表征圖1A和B分別為MMIPs的掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖。SEM圖中MMIPs納米粒子表面粗糙，增加了聚合物的比表面積，有利于實現(xiàn)吸附和解吸附，其尺寸均勻，粒徑約為200 nm。如TEM圖所示，在硅球外側(cè)觀察到了顏色更淺的印跡層，形態(tài)均勻,證明了分子印跡層被涂覆在磁性支撐材料表面。

2.2.2 MMIPs和MNIPs的紅外表征Fe3O4、Fe3O4@SiO2-CH=CH2和MMIPs的紅外光譜如圖1C所示。從Fe3O4的紅外譜圖可見，在560 cm-1附近為Fe-O的伸縮振動吸收峰。從Fe3O4@SiO2-CH=CH2的譜圖可以看出，Si-O、Si-OH、Si-O-Si、C=C的伸縮振動峰分別出現(xiàn)在810、943、1 090和1 635 cm-1附近，這表明乙烯基成功地修飾到Fe3O4@SiO2表面。MMIPs的紅外譜圖中，1 733 cm-1、2 950 cm-1、2 990 cm-1處吸收峰分別與C=O伸縮振動、亞甲基的C-H伸縮振動、甲基的伸縮振動有關(guān)，表明EGDMA和AM已經(jīng)聚合，成功制備了MMIPs。

2.2.3 MMIPs和MNIPs的磁性表征使用VSM考察Fe3O4、Fe3O4@SiO2和MMIPs的磁性能。磁滯回線如圖1D所示,三者的飽和磁化強度分別為63.46、41.82和25.42 emug-1。三條曲線均關(guān)于原點對稱，表明沒有磁滯現(xiàn)象，證明Fe3O4、Fe3O4@SiO2和MMIPs具有超順磁性。MMIPs的飽和磁化率可以實現(xiàn)外加磁場下的快速分離。

2.3 MMIPs與MNIPs的吸附性能試驗

2.3.1 靜態(tài)吸附實驗圖2A是MMIPs的吸附等溫線。結(jié)果表明,當濃度小于15 mg/L時,MMIPs吸附容量隨濃度的增加而快速增加。當初始濃度接近15 mg/L時，吸附曲線逐漸平穩(wěn),吸附量逐漸飽和。MMIPs的飽和吸附容量為8.68 mg/g，約為MNIPs(1.43 mg/g)的6.1倍。在不同濃度下，MMIPs對迷迭香酸的吸附效果均顯著高于MNIPs，證明MMIPs對迷迭香酸具有良好的吸附效果。

2.3.2 動態(tài)吸附試驗圖2B是24 mg/L迷迭香酸溶液下，MMIPs和MNIPs的吸附動力學曲線，兩種聚合物的吸附量隨接振蕩時間的增加而增加，但吸附速率逐漸降低，這表明聚合物上的結(jié)合位點逐漸吸附飽和。在40 min左右基本達到吸附平衡，其平衡吸附量為8.35 mg/g。然而在MNIPs中，吸附主要發(fā)生在MNIPs表面暴露的非印跡位點上，使得其更快地達到吸附平衡。該快速吸附為MMIPs的實際應用奠定了基礎。

圖2 MMIPs和MNIPs對迷迭香酸的吸附等溫線(A)和吸附動力學曲線(B)Fig.2 Adsorption isotherms(A) and adsorption kinetic curves(B) of RosA by MMIPs and MNIPs

2.4 選擇性實驗

MMIPs和MNIPs對迷迭香酸、桑黃素和辣椒堿的吸附量如圖3所示。結(jié)果表明，MMIPs對迷迭香酸的吸附量和特異性明顯高于其他結(jié)構(gòu)類似物。迷迭香酸、桑黃素和辣椒堿的印跡因子分別為4.98、2.65和1.37。桑黃素和辣椒堿的選擇性系數(shù)分別為2.03和3.16。因為結(jié)構(gòu)類似物在形狀、大小和空間結(jié)構(gòu)上與吸附位點不完全匹配，導致其吸附量低。這表明MMIPs能夠特異性識別迷迭香酸。

2.5 穩(wěn)定性試驗

為了評價R-MMIPs的穩(wěn)定性，在相同的實驗條件下，測定了MMIPs對迷迭香酸連續(xù)吸附-解吸的吸附能力。如圖4所示，MMIPs對迷迭香酸的吸附效率經(jīng)6次循環(huán)后僅下降5.8%，印跡聚合物的三維孔隙非常穩(wěn)定，洗脫過程影響很小。結(jié)果表明，MMIPs重復使用后對迷迭香酸仍具有較好的結(jié)合能力。

圖3 MMIPs和MNIPs對迷迭香酸、桑黃素、辣椒堿的吸附容量Fig.3 Adsorption capacity of MMIPs and MNIPs for RosA,Morin and Capsaicin

圖4 MMIPs的重復性實驗Fig.4 Repeatability test of MMIPs

圖5 加標樣品(a)和R-MMIPs純化后加標樣品(b)色譜圖Fig.5 Chromatograms of spiked sample(a) and spiked enriched sample(b)

2.6 實際樣品中的應用

利用R-MMIPs對紫蘇加標樣品中的迷迭香酸進行分離和富集。如圖5a所示，紫蘇樣品的提取液是一個復雜的基質(zhì)。加標溶液經(jīng)R-MMIPs富集后，溶液中干擾物含量明顯減少(圖5b)。結(jié)果表明，R-MMIPs對迷迭香酸具有明顯的特異性識別和純化能力。

方法學驗證采用HPLC-DAD結(jié)合線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)來考察。迷迭香酸在0.3～50 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9993。按信噪比的3倍和10倍計算，檢出限和定量限分別為0.35 μg/mL和1.10 μg/mL。在15 μg/mL、25 μg/mL、35 μg/mL三個不同加標水平下向紫蘇樣品中添加迷迭香酸，對該方法的準確度和精密度進行評價(表2)，加標回收率為88.1%～107.5%，相對標準偏差(RSD)為1.58%～4.42%(<5%)。結(jié)果表明，所建立的方法準確、可行、選擇性好，可用于實際樣品中迷迭香酸的提取和測定。

表2 樣品中迷迭香酸的加標回收率(n=3)

3 結(jié)論

本文成功合成了迷迭香酸磁性分子印聚合物(R-MMIPs)，其具有吸附能力強(Qmax=8.68 mg/g)、特異性高(印跡因子為4.98)和穩(wěn)定性好等優(yōu)點。對R-MMIPs微觀結(jié)構(gòu)進行了系統(tǒng)表征，該納米材料粒徑均勻，磁性強，在外加磁場下能夠?qū)崿F(xiàn)快速分離，無需離心或過濾。將MMIPs-HPLC成功應用于紫蘇中迷迭香酸的分離和檢測，樣品加標回收率為88.1%～107.8%。為迷迭香酸等小分子天然產(chǎn)物的分離檢測提供了一種高效的方法。