張愛菊， 白 瑩， 董 娜， 薛林科， 戴興德， 張小林*

(甘肅醫(yī)學(xué)院，甘肅平?jīng)?744000)

過氧化氫酶(CAT)廣泛存在于生物組織細胞中，可適時分解糖代謝中間產(chǎn)物H2O2，在抗衰老、防病變等方面發(fā)揮重要生理作用[1,2]。自1811年CAT首次被發(fā)現(xiàn)以來，關(guān)于其活性測定方法的研究從未停止，相繼出現(xiàn)了滴定法[3]、光度法[4 - 8]。目前，研究的熱點主要集中于催化光度法[9]。

熒光光度法集穩(wěn)定性、高靈敏性、低成本等于一體，羅丹明B(Rhodamine B，RhB)結(jié)構(gòu)特殊，熒光產(chǎn)率高[10,11]，當(dāng)其醌式結(jié)構(gòu)遭到破壞，分子失去平面剛性結(jié)構(gòu)而發(fā)生熒光猝滅。羅丹明B作為熒光探針在微量分析領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[12 - 14]，有文獻報道碘-羅丹明B締合物熒光探針用于測定魚肝提取液中CAT活度[15]。本文實驗發(fā)現(xiàn)，在Fe2+和H2O2的共同作用下，羅丹明B也存在熒光猝滅現(xiàn)象，CAT分解H2O2使羅丹明B熒光得以保留，根據(jù)CAT加入前后熒光強度差值ΔF可求得CAT活度。實驗對反應(yīng)條件和抗干擾能力做了詳細考察，發(fā)現(xiàn)檢測體系具有更理想的穩(wěn)定性和環(huán)境適應(yīng)性，血清微量獲取并可直接用于酶活度檢測，方法有望早日應(yīng)用于臨床檢驗。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

930N熒光光度計(上海精科)。

H2O2(30%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)：將30%H2O2稀釋500倍，化學(xué)分析法測其濃度，逐級稀釋1×10-3mol/L。CAT(≥3 000 U/mg,阿拉丁)標(biāo)準(zhǔn)溶液，稱取0.0050 g CAT，蒸餾水溶解，100 mL容量瓶定容，化學(xué)分析法測活度(E=100 U/mL)，二次稀釋至1 u/mL。羅丹明B(RhB)溶液：分析天平稱取0.0250 g RhB(分析純，福晨化學(xué)試劑有限公司)，蒸餾水溶解，500 mL容量瓶定容，根據(jù)準(zhǔn)確濃度二次稀釋至1×10-4mol/L。0.1 mol/L pH 4.2的HAc-NaAc緩沖溶液。

1.2 測定方法

在50 mL的容量瓶中加入血清(25～100 μL)和H2O2(2.80 mL)，30 ℃水浴反應(yīng)10 min，然后依次加入羅丹明B(5.00 mL)、HAc-NaAc(2.50 mL)和Fe2+(0.40 mL)，常溫靜置15 min后定容，蒸餾水作參比，在585 nm發(fā)射波長處測熒光強度F。同步測定酶空白體系F0(在血清中先加入羅丹明B、緩沖溶液和Fe2+，振蕩30 s使酶失活，再加H2O2室溫反應(yīng)15 min)。CAT活度E(1 mL CAT溶液所消耗H2O2物質(zhì)的量(μmol))由ΔF(ΔF=F-F0)確定。

2 結(jié)果討論

2.1 光譜分析

在585 nm處，羅丹明B有特征熒光峰(圖1a)；Fe2+作催化劑，H2O2氧化羅丹明B致其熒光猝滅，熒光強度F減小(圖1b)；CAT分解H2O2使得體系中H2O2濃度降低，從而一定程度上保持了羅丹明B的熒光(圖1c)，熒光保留程度與CAT活度有關(guān)系。本實驗確定羅丹明B熒光發(fā)射波長為585 nm。

2.2 熒光猝滅條件考察

2.2.1 催化劑考察本文選擇Fe2+和Fe3+作催化劑并對催化性能作比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：羅丹明B和RhB+H2O2兩體系熒光光譜保持一致(圖2a)，說明在無催化劑情況下，H2O2不能氧化RhB；加入H2O2，同時加入Fe2+或Fe3+后，均出現(xiàn)熒光猝滅(圖2b、圖2c)，F(xiàn)e2+作用下的羅丹明B猝滅程度更大(圖2b)；不加H2O2時，F(xiàn)e2+和Fe3+分別與羅丹明B混合，F(xiàn)e2+對羅丹明B無影響，而Fe3+亦可實現(xiàn)羅丹明B熒光等效猝滅(圖2d)。由此說明，F(xiàn)e3+不是催化劑而是氧化劑；本實驗選擇Fe2+作熒光猝滅反應(yīng)的催化劑。

圖1 不同溶液的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of different solutions

圖2 催化作用比較Fig.2 Comparison of catalysis

2.2.2 羅丹明B用量酶活性的測定范圍與羅丹明B的用量有著密切的關(guān)系，若羅丹明B的用量偏小，酶活性的測定范圍變窄；若用量偏大，分子之間的締合作用導(dǎo)致體系的穩(wěn)定性變差，測定準(zhǔn)確度降低。pH 4.2 HAc-NaAc緩沖介質(zhì)中，考察羅丹明B熒光強度隨溶液體積的變化情況。結(jié)果顯示，體系的熒光強度F值隨著溶液體積的增大而逐漸增大，當(dāng)羅丹明B在0.00～5.00 mL范圍內(nèi)時，熒光強度與體積有線性關(guān)系，因此羅丹明B的最佳用量確定為5.00 mL，此時羅丹明B反應(yīng)液濃度為1.0×10-5mol/L。

2.2.3 溶液pH考察RhB熒光猝滅實為氧化反應(yīng)，酸性環(huán)境更有利于H2O2得電子，也將最大限度減少Fe2+沉淀損失。對于熒光猝滅反應(yīng)體系H2O2+RhB+Fe2+，其它條件不變，在pH 1.0～5.5范圍內(nèi)進行溶液pH考察，結(jié)果表明，熒光強度在pH 4.2出現(xiàn)一最低值，故選擇HAc-NaAc緩沖溶液作猝滅反應(yīng)介質(zhì)，最佳用量確定為2.50 mL。

2.2.4 熒光猝滅反應(yīng)時間考察其它條件不變，考察氧化反應(yīng)時間對H2O2+RhB+Fe2+體系熒光強度的影響。結(jié)果表明，在催化劑Fe2+的作用下，羅丹明B快速被氧化，熒光強度在5 min內(nèi)迅速下降，5 min后反應(yīng)變緩，15 min后降到最低且保持恒定。因此猝滅反應(yīng)時間確定為15 min。

2.2.5 Fe2+用量的選擇其它條件不變，在0.00～0.20 mL范圍內(nèi)，測定加入不同體積Fe2+時的H2O2+RhB+Fe2+體系熒光強度。結(jié)果可知，當(dāng)V(Fe2+)=0.00 mL時，羅丹明B與H2O2幾乎不反應(yīng)；熒光強度F隨Fe2+體積增大而減??；當(dāng)V(Fe2+)>0.60 mL時，熒光猝滅反應(yīng)程度受限，應(yīng)該是過量Fe2+促使H2O2分解。因此，F(xiàn)e2+用量設(shè)定為0.40 mL。

2.3 酶促反應(yīng)條件優(yōu)化

2.3.1 底物H2O2體積優(yōu)化針對酶空白體系，在最佳猝滅反應(yīng)條件下，改變H2O2體積用量，測定熒光強度。結(jié)果顯示熒光強度隨H2O2體積增加而減小，在0.00～2.80 mL范圍內(nèi)有明顯的猝滅現(xiàn)象，且熒光強度和H2O2體積有良好的線性關(guān)系，當(dāng)H2O2體積大于2.80 mL時，線性關(guān)系變差。為了增大酶活性測定范圍，減小系統(tǒng)誤差，取1×10-3mol/L H2O2溶液2.80 mL作酶反應(yīng)底物。

2.3.2 酶促反應(yīng)時間影響取CAT標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，僅改變酶促反應(yīng)時間，測定ΔF。結(jié)果表明，酶促反應(yīng)速度較快，前5min，ΔF與時間有線性關(guān)系，這符合一級反應(yīng)特征；10 min后，ΔF保持一個最大值恒定不變。故將酶促反應(yīng)時間定為10 min。

2.4 方法對CAT的分析性能

針對CAT+H2O2+RhB+Fe2+體系，在0.00～3.50 mL體積范圍內(nèi)改變CAT標(biāo)準(zhǔn)溶液用量，在最佳條件下測定F、F0并計算ΔF，繪制工作曲線。結(jié)果顯示：CAT的加入促使羅丹明B熒光恢復(fù)(圖3)，熒光強度增幅ΔF與CAT活度E在5.6×10-5～5.6×10-2U/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(圖3內(nèi)插圖)：ΔF=-3.466+1 472E(U/mL)，r=0.9962，平行測定酶空白10次，標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍除以斜率求得檢測限為2.6×10-5U/mL。

圖3 測定CAT的熒光光譜及活度工作曲線Fig.3 Fluorescence spectra of CAT and plot for CAT activity

2.5 血清共存物質(zhì)的影響

2.6 反應(yīng)機理的探討

不存在Fe2+時，H2O2幾乎不與RhB反應(yīng)，在30 ℃恒溫60 min后體系的熒光強度基本保持不變。在H2O2和RhB溶液中加入少量Fe2+后，反應(yīng)迅速，結(jié)合相關(guān)研究[16]，反應(yīng)機理推測如下:

Fe2++H2O2=Fe3++OH-+HO·

Fe3++H2O2+OH-=Fe2++H2O+HO·

Fe3++H2O2=Fe2++H++·HO2

·HO2+H2O2=H2O+O2↑+HO·

活性物質(zhì)HO·攻擊RhB的發(fā)色基團并使其降解，直至轉(zhuǎn)化成CO2和H2O，發(fā)生熒光猝滅。

2.7 血清酶活度分析

對6份血清(由甘肅醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心提供，屬于正常個體)樣本CAT活度按“1.2測定方法”進行測定，并和碘量法作對比，結(jié)果見表1。血清CAT活度測定值在28～31 U/mL范圍內(nèi)，結(jié)果與碘量法基本保持一致；加標(biāo)回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差計算進一步證明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和較高的精密度。

表1 樣品分析及回收率實驗結(jié)果(n=6)