于 峰， 魏 萌， 文 迪， 苗鑫剛， 張路迪， 張曉光

(1.河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省法醫(yī)分子鑒定協(xié)同創(chuàng)新中心，河北石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，河北石家莊 050031；3.河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)鑒定中心，河北石家莊 050017；4.河北醫(yī)科大學(xué)，醫(yī)學(xué)與健康研究院大型科研儀器設(shè)備共享服務(wù)平臺(tái)，河北石家莊 050017)

目前較為廣泛應(yīng)用的鎮(zhèn)定催眠類藥物主要有苯二氮卓類、吩噻嗪類、巴比妥類等，這些藥物具有改善睡眠、鎮(zhèn)定、抵抗抑郁和焦慮等作用，但容易使患者產(chǎn)生依賴或者成癮，過(guò)量服用會(huì)造成物理和精神的傷害，甚至呼吸衰竭死亡[1 -2 ]。因此,建立檢測(cè)這些藥物的準(zhǔn)確快捷的方法十分必要[3]。干血斑法是指將采集的微量血樣本置于采血卡上，經(jīng)干燥后制成干血斑樣品，其具有創(chuàng)傷小，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，后處理簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)。隨著質(zhì)譜技術(shù)在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方面研究的開(kāi)展，干血斑技術(shù)目前已經(jīng)在疾病標(biāo)志物篩查、藥物動(dòng)力學(xué)研究、臨床藥物監(jiān)測(cè)等方面[4 -2 ]得到廣泛的應(yīng)用。

基質(zhì)分散固相萃取法最初由美國(guó)路易斯安納州立大學(xué)Staren Barker教授提出，它的原理是將硅膠鍵合有機(jī)相的凈化填料放入萃取溶劑中，被檢測(cè)物質(zhì)和凈化填料在剪切力作用下分散開(kāi)來(lái)，被檢測(cè)物質(zhì)或者基質(zhì)中雜質(zhì)被吸附，使用不同極性溶劑進(jìn)行解吸，從而達(dá)到凈化目的[13 -15 ]。

目前,文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)鎮(zhèn)定安眠藥物的方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法以及高分辨率質(zhì)譜法等[16 -21 ]。靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜是近年來(lái)興起的先進(jìn)的質(zhì)譜分析技術(shù)，具有高通量、精確度高、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，其通過(guò)記錄被測(cè)物質(zhì)加和離子在電場(chǎng)內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡和頻率，經(jīng)過(guò)傅里葉轉(zhuǎn)換得到精確質(zhì)量數(shù)。使用干血斑結(jié)合靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜法檢測(cè)鎮(zhèn)定催眠藥物鮮有報(bào)道，與已有研究相比，本研究?jī)?yōu)勢(shì)在于被測(cè)物種類全面，檢出限低，分析時(shí)間短，前處理簡(jiǎn)單高效，通過(guò)對(duì)被分析物的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性和定量，從而極大降低假陽(yáng)性出現(xiàn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

QE-plus型超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛世爾公司)；CT15RE型高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)；Vortex3000型渦旋混勻器(德國(guó)維根技術(shù)有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1×100 mm，1.7 μm，美國(guó)沃特世公司)；Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色譜柱(2.1×100 mm，1.9 μm，美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；Phenomenex Kinetex C18色譜柱(2.1×100 mm，2.6 μm，美國(guó)菲諾美公司)；Milli-Q Advantage A10超純水儀(美國(guó)默克密理博公司) 。

22種安眠鎮(zhèn)定類藥物標(biāo)準(zhǔn)品(苯二氮卓類：奧沙西泮、地西泮、勞拉西泮、氯硝西泮、替馬西泮、硝西泮、去甲西泮、7氨基氯硝西泮、氟西泮、氯氮平、阿普唑侖、艾司唑侖、咪達(dá)唑侖、三唑侖；吩噻嗪類：丙咪嗪、氯丙嗪、異丙嗪、甲哌氯丙嗪；巴比妥類：巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥、異戊巴比妥)濃度均為1 000 μg/mL，溶劑甲醇(壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)，3種內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(地西泮D5、苯巴比妥D5、氯丙嗪D6)濃度均為100 μg/mL，溶劑甲醇(天津阿爾塔科技有限公司)；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、甲酸(99%)、乙酸銨(99%)、甲酸銨(99%)均購(gòu)于美國(guó)默克密理博公司； C18粉末(50 μm，60 ?)、PSA粉末(40～63 μm，60 ?)購(gòu)于天津博納艾杰爾公司；Whatman 903采血卡(美國(guó)思拓凡公司)；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

全血樣品(河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)鑒定中心提供)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別移取22種安眠鎮(zhèn)定類藥物標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，用甲醇定溶于10 mL容量瓶中，配制成10 000 ng/mL的混標(biāo)使用液1；混標(biāo)使用液1以甲醇稀釋定容可分別制得1 000 ng/mL的混標(biāo)使用液2及100 ng/mL的混標(biāo)使用液3；分別移取3種內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品1 000 μL，用甲醇定溶于10 mL容量瓶中，配制成10 000 ng/mL的混標(biāo)內(nèi)標(biāo)使用液。

1.3 干血斑的制備

移取全血50 μL于Whatman 903采血卡上，溫室條件下放置2 h得干血斑樣品，置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 樣品前處理

沿虛線邊緣處將干血斑裁剪下來(lái)，將其放入2 mL離心管中，加入10 μL(100 ng)混合內(nèi)標(biāo)使用液，40 μL甲醇水溶液(體積比1∶1)浸潤(rùn)干血斑，再加入950 μL乙腈，渦旋60 s，30 ℃超聲5 min，10 000 g/min，4 ℃下離心5 min；移取全部上清液于另一2 mL離心管中，加入PSA 100 mg，震蕩混勻，渦旋60 s，10 000 g/min，4 ℃下離心5 min；取上清液500 μL于另一2 mL離心管中，50 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL甲醇水溶液(體積比1∶3)復(fù)溶，10 000 g/min，4 ℃下離心1 min，取上清液上機(jī)測(cè)定。

1.5 基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

移取適量“1.2”混標(biāo)使用液于9個(gè)2 mL離心管中，使離心管含有被測(cè)物質(zhì)量依次為2 ng、5 ng、8 ng、20 ng、40 ng、80 ng、200 ng、400 ng、800 ng；氮?dú)庑⌒拇蹈呻x心管，加入50 μL甲醇水溶液(體積比1∶1)復(fù)溶，渦旋30 s，再加入950 μL全血，渦旋混勻60 s，得到被測(cè)物濃度為2 ng/mL、5 ng/mL、8 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。取制成的血液基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 μL于Whatman 903采血卡上，溫室條件下放置2 h即得，放置于-20 ℃冰箱保存。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法

按照“1.3”制備干血斑，沿虛線邊緣處將干血斑裁剪下來(lái)，將其放入2 mL離心管中，加入50 μL甲醇水溶液(體積比1∶1)浸潤(rùn)干血斑，加入950 μL乙腈，渦旋60 s，30 ℃超聲5 min，10 000 g/min，4 ℃下離心5 min；取上清液500 μL于另一2mL離心管中，50 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?，移取?.2”制備的適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入甲醇水溶液(體積比1∶3)補(bǔ)足，使苯二氮卓類、吩噻嗪類添加濃度為10 ng/mL、400 ng/mL、600 ng/mL，巴比妥類添加濃度為40 ng/mL、400 ng/mL、600 ng/mL。同時(shí)用甲醇水溶液(體積比1∶3)直接配制成與上述濃度相同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測(cè)定，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定3次。

1.7 外標(biāo)法回收率測(cè)定方法

移取全血50 μL于Whatman903采血卡上(其中被測(cè)物濃度為40 ng/mL，400 ng/mL，600 ng/mL，按照“1.2”、“1.3”制備)不加入內(nèi)標(biāo)，改變PSA和C18加入量，加入PSA量依次為50 mg、100 mg、150 mg，加入C18量依次為50 mg、100 mg、150 mg，按照“1.4”進(jìn)行樣品前處理。

1.8 儀器條件

1.8.1 色譜條件色譜柱：Waters Acquity BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)以及預(yù)柱(5 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相相A 為10 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈溶液；洗脫梯度：0～2 min，25%B；2～9 min，25%B線性升高至90%B；9～10 min，90%B；10～11 min，90%B線性降低至25%B；11～12 min，25%B；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL。

1.8.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧電離源(HESI)，離子源電壓：3 800 V，離子源溫度：350 ℃；鞘氣流速：40 arb；輔助氣流速：10 arb；毛細(xì)傳輸管溫度：320 ℃；S-lens RF level：60；掃描方式：一級(jí)質(zhì)譜全掃描加數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)質(zhì)譜掃描(Full MS ddMS2)；掃描模式：正負(fù)切換；一級(jí)質(zhì)譜全掃描分辨率：70 000；掃描范圍：150～1 000m/z；二級(jí)質(zhì)譜掃描分辨率：17 500；能量值(NCE stepped)：20、30、40；AGC target：1e5。

2 結(jié)果和討論

2.1 基質(zhì)分散固相萃取條件的確定

2.1.1 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)按照“1.6”進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)。基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積記為S，直接配制的相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積記為S0，以(S-S0)/S0×100%評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)中22種目標(biāo)物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)范圍為-20.7%至-8.5%之間，均為抑制效應(yīng)。

2.1.2 凈化劑的選擇及用量實(shí)驗(yàn)選用C18和PSA作為凈化劑，以回收率作為考察方式，確定凈化劑的用量。內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)峰面積由于基質(zhì)效應(yīng)同時(shí)增強(qiáng)或者抑制，使用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算回收率無(wú)法準(zhǔn)確反映基質(zhì)效應(yīng)造成的影響，因此使用添加和不添加凈化劑時(shí)的峰面積之比來(lái)考察凈化劑的效果。

改變C18粉末和PSA粉末的用量，按照“1.7”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在僅添加C18的實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)現(xiàn)被測(cè)物回收率和不添加C18時(shí)峰面積無(wú)顯著差異。在添加PSA粉末的情況下，除了司可巴比妥以外，其他被測(cè)物峰面積與不添加PSA粉末時(shí)相比均有不同程度的增加，這說(shuō)明PSA對(duì)于血液樣品具有更好的凈化效果。其原因可能是PSA的氨基可與金屬離子產(chǎn)生鰲合作用，從而有效的吸附了血液提取液中的金屬離子以及脂類、有機(jī)酸、糖類，降低了基質(zhì)效應(yīng)。具體峰面積變化和添加量之間的關(guān)系如圖1所示(被測(cè)物濃度為40 ng/mL)，但是隨著添加量的增多，硝西泮、地西泮、異丙嗪、司可巴比妥、巴比妥等峰面積出現(xiàn)了明顯下降，這可能是由于PSA對(duì)被測(cè)物的吸附作用增強(qiáng)導(dǎo)致，在被測(cè)物濃度為400 ng/mL以及600 ng/mL的情況下改變PSA用量，也有相似的趨勢(shì)。綜合考慮，PSA添加量確定為100 mg。

圖1 添加不同量的PSA凈化劑條件下峰面積變化情況Fig.1 Effect of different dosage PSA on peak area a.benzodiazepines;b.phenothiazines;c.barbiturates.

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇比較了Waters Acquity BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)和Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)出峰和分離情況。結(jié)果顯示，3種色譜柱在12 min內(nèi)均可以實(shí)現(xiàn)22種被分析物質(zhì)的色譜分離。但是Hypersil GOLD C18色譜柱對(duì)于苯二氮卓類的分離效果和其他兩種色譜柱相比出峰時(shí)間更加集中，Kinetex C18色譜柱色譜柱對(duì)于巴比妥類的分離效果和其他兩種色譜柱相比出峰時(shí)間更加集中； Acquity BEH C18色譜柱在分離效果方面表現(xiàn)得更加均衡。在Waters Acquity BEH C18色譜柱上吩噻嗪類和巴比妥類出峰峰形較其余兩種色譜柱更加對(duì)稱和尖銳，最終選擇Waters Acquity BEH C18色譜柱作為分析柱。22種被測(cè)物的離子流色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 22種被測(cè)物離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of 22 analytes

2.2.2 流動(dòng)相的選擇比較了甲酸銨水溶液-甲醇、甲酸銨水溶液-乙腈、乙酸銨水溶液-甲醇、乙酸銨水溶液-乙腈4種不同的流動(dòng)體系下，22種被測(cè)物的出峰和分離情況。結(jié)果顯示，使用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，被測(cè)物出峰時(shí)間要早于使用甲醇作為有機(jī)相的出峰時(shí)間。對(duì)于地西泮、氯丙嗪、異丙嗪、甲哌異丙嗪、丙咪嗪，使用甲醇出峰時(shí)間均在8～10 min，此時(shí)有機(jī)相的比例最高(90%)，共流出雜質(zhì)增多，基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致出峰面積下降；此外，對(duì)于巴比妥類物質(zhì)，使用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)峰面積要明顯大于使用甲醇作為流動(dòng)相的峰面積。使用甲酸銨水溶液作為流動(dòng)相和乙酸銨水溶液相比，苯二氮卓類和吩噻嗪類在峰面積、峰形方面無(wú)明顯差異，但是對(duì)于巴比妥類物質(zhì)，使用乙酸銨水溶液要大于使用甲酸銨水溶液出峰峰面積，因此最終選擇使用乙酸銨水溶液-乙腈體系作為流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于苯二氮卓類和吩噻嗪類物質(zhì)離子化為[M+H]正模式，而巴比妥類離子化為[M-H]負(fù)模式，本儀器可以實(shí)現(xiàn)正負(fù)切換掃描，理論上可以節(jié)省一半儀器運(yùn)行時(shí)間，但是正負(fù)切換掃描可能會(huì)帶來(lái)掃描信息的丟失，因此本實(shí)驗(yàn)比較了正負(fù)切換同時(shí)掃描、正模式掃描、負(fù)模式掃描3種掃描方式下22種被測(cè)物質(zhì)的出峰情況。結(jié)果表明，苯二氮卓類和吩噻嗪類正負(fù)切換掃描下靈敏度、峰面積和單正模式掃描下無(wú)明顯差異，巴比妥類在正負(fù)切換掃描下峰面積出現(xiàn)了一定下降，但是下降幅度在10%之內(nèi)，在正負(fù)切換掃描模式下，22種被測(cè)物靈敏度、線性范圍、穩(wěn)定性表現(xiàn)良好。綜合考慮，本方法最終確定使用正負(fù)切換掃描，以提取的母離子精確質(zhì)量數(shù)定性和定量，以提取的子離子精確質(zhì)量數(shù)作為輔助定性，22種被測(cè)物的儀器實(shí)際提取質(zhì)量數(shù)與理論質(zhì)量數(shù)誤差均在5 ppm之內(nèi)，極大的減少了傳統(tǒng)四極桿質(zhì)譜假陽(yáng)性或者假陰性的出現(xiàn)。22種被測(cè)物的分子式，理論質(zhì)量數(shù)，典型子離子見(jiàn)表1。

表1 22種被測(cè)物分子式、特征離子(n=5)

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 檢出限、定量限、線性方程和線性范圍按照“1.5”制作干血斑樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線，以外標(biāo)峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值作為縱坐標(biāo)y(其中苯二氮卓類以地西泮D5為內(nèi)標(biāo)、吩噻嗪類以氯丙嗪D6為內(nèi)標(biāo)、巴比妥類以苯巴比妥D5為內(nèi)標(biāo))，以被測(cè)物濃度作為橫坐標(biāo)x，進(jìn)行線性擬合，得到線性方程。以3倍信噪比和10倍信噪比確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果如表2所示。苯二氮卓類、吩噻嗪類在5 ng/mL～800 ng/mL范圍內(nèi)線性表現(xiàn)良好(r2>0.99)，巴比妥類在20 ng/mL～800 ng/mL范圍內(nèi)線性表現(xiàn)良好(r2>0.99)，滿足了日常司法檢測(cè)的需要。

2.4.2 回收率和精密度取空白血樣，添加低、中、高三水平的被測(cè)物(苯二氮卓類、吩噻嗪類添加濃度為低水平10 ng/mL、中水平400 ng/mL、高水平600 ng/mL，巴比妥類添加濃度為低水平40 ng/mL、中水平400 ng/mL、高水平600 ng/mL)，按照1.2、1.3、1.4進(jìn)行前處理，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見(jiàn)下表2。結(jié)果表明，22種被測(cè)物回收率在80.2%～113.5%范圍內(nèi)，RSD在0.9%～14.3%范圍內(nèi)，滿足方法學(xué)要求。

表2 22種被測(cè)物線性方程、檢出限、定量限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.4.3 樣品穩(wěn)定性取空白血樣，添加低、中、高3水平(苯二氮卓類、吩噻嗪類添加濃度為10 ng/mL、400 ng/mL、600 ng/mL，巴比妥類添加濃度為40 ng/mL、400 ng/mL、600 ng/mL)的被測(cè)物，按照“1.2”、“1.3”制備干血斑樣品，分成3組，分儲(chǔ)于4 ℃、-20 ℃、-40 ℃條件下，在1、2、3、5、7、10、15、20、30天后進(jìn)行測(cè)定，每組每個(gè)水平平行測(cè)定5次。結(jié)果表明，在-20 ℃以及-40 ℃保存條件下，被測(cè)物質(zhì)30天內(nèi)穩(wěn)定性良好，測(cè)定結(jié)果RSD值在15%之內(nèi)。4 ℃下，被測(cè)物7內(nèi)穩(wěn)定性良好，但是7天后穩(wěn)定性變差，地西泮、地西泮、勞拉西泮、替馬西泮、硝西泮、異丙嗪、苯巴比妥測(cè)定結(jié)果RSD值高于20%。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

收集了3份非正常死亡人員陽(yáng)性血樣，應(yīng)用本方法和《SF/Z JD0107005-2016血液、尿液中238種毒(藥)物的檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》對(duì)樣品進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。本方法和應(yīng)用司法技術(shù)規(guī)范檢測(cè)的相對(duì)偏差在10%之內(nèi)，可作為司法技術(shù)規(guī)范的補(bǔ)充檢測(cè)方法或者確證方法。

表3 本方法和司法技術(shù)規(guī)范方法的結(jié)果對(duì)比

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)干血斑樣本中22種鎮(zhèn)定安眠藥成分進(jìn)行了測(cè)定，干血斑樣品經(jīng)過(guò)乙腈提取后，應(yīng)用基質(zhì)分散固相萃取法進(jìn)行凈化。結(jié)果表明：22種被測(cè)物質(zhì)在線性范圍、檢出限、定量限、回收率以及穩(wěn)定性等方面符合方法學(xué)要求，該方法樣本存儲(chǔ)方便，保存時(shí)間長(zhǎng)，前處理操作簡(jiǎn)單，為臨床藥物研究和法醫(yī)毒物分析提供了新的技術(shù)支持。本研究?jī)H選擇了兩種基質(zhì)分散固相萃取劑，沒(méi)有開(kāi)展對(duì)于不同指標(biāo)類型血，以及不同干血斑產(chǎn)品的適用性方面優(yōu)選工作，今后研究中，可以從這些方面進(jìn)行更多的嘗試。干血斑-質(zhì)譜法在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)檢測(cè)、藥物研究、疾病診斷等方面具有良好的應(yīng)用前景。