劉長青， 廖楚健， 周素蓮， 易忠勝， 陶慧林

(1.青海省有色第一地質(zhì)勘察院，青海西寧 810006；2.桂林市恭城瑤族自治縣婦幼保健院，廣西桂林 542500；3.桂林理工大學(xué)南寧分校，廣西南寧 530001；4.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西桂林 541004)

鹽酸強力霉素(Doxycycline hyclate,DOX)是四環(huán)素族半合成抗生素，主要用作抗革蘭氏陽性及陰性菌感染，不僅抗菌作用強，而且對四環(huán)素等耐藥的金黃色葡萄球菌有效，國內(nèi)外應(yīng)用較廣[1]。大量的鹽酸強力霉素排放到環(huán)境中，從而對生態(tài)系統(tǒng)和人體造成危害[2]。因此，有必要對DOX殘留進行監(jiān)控。目前，文獻報道測定DOX的方法主要有比色法[3]、電化學(xué)法[1,4]、毛細管電泳法[5]、高效液相色譜法[6]、熒光光譜法[7,8]等。但這些方法成本較高，且需要復(fù)雜的樣品前處理和繁瑣的檢測步驟。因此，研究建立快速、準確的DOX分析技術(shù)，具有重要的科學(xué)意義。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)是指一個熒光基團(供體，Donor)的發(fā)射光譜與另一個基團(受體，Acceptor)的吸收光譜有一定范圍的重疊，分子間的距離小于10 nm時，受體分子吸收來自供體分子能量的現(xiàn)象，是一種非輻射躍遷[9,10]。

近幾年來，具有優(yōu)良光學(xué)特性量子點已逐步代替?zhèn)鹘y(tǒng)染料用來建立熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系。目前，在各類物質(zhì)分析檢測上有很大的發(fā)展[11 - 13]。但是常用的半導(dǎo)體量子點多含有Cd、Pb、S等具有較強環(huán)境和生物毒性的元素，危害較大。雖然Zn也是一種重金屬，但其毒性遠遠小于Cd和Pb，且Zn和Se都是生物體必須的微量元素。而大量研究表明，CQDs生物、環(huán)境毒性很小。ZnSe量子點作為供體，CQDs作為受體建立的FRET體系用于檢測DOX的研究目前國內(nèi)外尚未見報道。本文提出使用的ZnSe量子點為熒光供體，CQDs為受體構(gòu)建FRET體系，在充分利用量子點所擁有的優(yōu)勢的同時，又大大降低了量子點中毒性元素對環(huán)境造成的危害。最終基于該體系建立一個操作方便，設(shè)備簡單，靈敏度高且對環(huán)境友好的測定DOX的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

RF-5301PC熒光光度計(日本島津)；TU-1901紫外可見分光光度計(北京儀器公司)；電子分析天平FA1244(中國江蘇儀器廠)；精密pH計(上海儀器廠)；JEM-1400型透射電子顯微鏡(TEM，日本電子)。

硒粉(AR，麥克林)；谷胱甘肽(BR，源葉生物)。三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl，pH=7.2)；鹽酸強力霉素(DOX)標準溶液；實驗所用試劑均為分析純，所有用水均為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 ZnSe量子點的制備參照文獻方法[14]并作適當(dāng)修改，首先稱取硒粉0.0078 g，硼氫化鈉0.0140 g加入細口瓶中，再加入300 μL二次水，冰浴40 min至硒粉完全溶解，得到無色透明的NaHSe溶液，備用。另取一個潔凈的三口燒瓶，加入0.0880 g乙酸鋅、0.1200 g谷胱甘肽和100 mL二次水，使用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)至pH=11。在強磁力攪拌下，繼續(xù)通氮氣除氧20 min，隨后迅速加入備用的NaHSe溶液，繼續(xù)在氮氣的保護下，于95 ℃下連續(xù)攪拌回流1.5 h，即可獲得無色透明的ZnSe水溶性量子點溶液，并于4 ℃冰箱中保存，待用。

1.2.2 CQDs的制備按文獻方法[15]并作適當(dāng)修改，在反應(yīng)釜的聚四氟乙烯內(nèi)襯中依次加入檸檬酸鈉鹽0.20 g、碳酸氫銨1.50 g及10 mL蒸餾水，置于180 ℃鼓風(fēng)干燥箱中反應(yīng)4 h，冷卻至室溫。將反應(yīng)后的溶液裝入100 mL的容量瓶中，稀釋至刻度，置于避光冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DOX測定方法在一系列5 mL比色管中加入一定量的ZnSe、CQDs、DOX溶液，加入pH=7.2的Tris-HCl緩沖液1.50 mL，再用二次水定容至刻度，混勻，在25 ℃下放置反應(yīng)5 min后，于λex=340 nm下測定相應(yīng)熒光強度I。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZnSe與CQDs的表征及量子產(chǎn)率

圖1(a)和1(b)分別為ZnSe量子點和CQDs的TEM圖，由圖1(a)和1(b)可知，所合成的兩種量子點呈準球形分布、分散性較好，粒子尺寸分布較為集中，粒徑大小主要集中在3 nm到5 nm之間。

圖1 ZnSe量子點(a)與CQDs(b)的TEM圖Fig.1 TEM images of ZnSe(a) and CQDs(b)

采用參比法測定供體與受體的熒光量子產(chǎn)率Φ[16]。計算公式如下：

(1)

式中，Φu、Φs為待測物和參比標準物的熒光量子產(chǎn)率；Fu、Fs為待測物和參比物的積分熒光強度；Au、As為待測物和參比標準物的吸光度。

本文采用硫酸奎寧溶液作為熒光參比物質(zhì)。根據(jù)文獻報道[18]硫酸奎寧量子產(chǎn)率為0.55，據(jù)此測得ZnSe量子產(chǎn)率為0.21，CQDs量子產(chǎn)率為0.65。

2.2 ZnSe-CQDs能量轉(zhuǎn)移體系的構(gòu)建

供體的發(fā)射光譜和受體吸收光譜有一定程度的重疊是其分子間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的條件之一[10,17]。因此對ZnSe量子點的熒光光譜和CQDs的吸收光譜進行分析(圖2)。由圖2(a)可知，ZnSe量子點的熒光峰在380 nm左右(曲線2)，CQDs的吸收峰在340 nm左右(曲線1)，兩者差為40 nm，有良好的光譜重疊，為發(fā)生能量轉(zhuǎn)移提供了前提條件。其中ZnSe量子點作為能量供體，而CQDs為能量受體。

為了保證能量轉(zhuǎn)移效果，采用340 nm作為激發(fā)波長，這樣CQDs能夠被充分激發(fā)，而ZnSe量子點被激發(fā)的熒光峰較弱，這樣就能很好地驗證能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。結(jié)果如圖2(b)所示，體系中熒光供體ZnSe在380 nm處的熒光發(fā)生猝滅，將能量有效地轉(zhuǎn)移給受體CQDs，使CQDs在450 nm處的熒光顯著增強，說明在ZnSe-CQDs之間發(fā)生了明顯的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

為了進一步確定ZnSe-CQDs之間的FRET現(xiàn)象，測試了加入受體(CQDs)前后供體(ZnSe)熒光壽命的變化。如圖2(c)所示，供體的熒光壽命為6.65 ns，加入受體后其熒光壽命衰減為5.03 ns，加入受體后供體的熒光壽命發(fā)生了明顯變化。熒光壽命的測試結(jié)果再次證實了ZnSe-CQDs之間發(fā)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

圖2 (a) CQDs的吸收光譜(1)和ZnSe量子點的熒光光譜(2)；(b) ZnSe量子點(1),CQDs(2)和ZnSe-CQDs(3)的熒光發(fā)射光譜；(c)加入受體前(1)后(2)供體的熒光壽命衰減曲線。Fig.2 (a)Absorption spectrum of CQDs(1) and fluorescence spectrum of ZnSe(2);(b)Fluorescence spectra of ZnSe(1),CQDs(2) and the mixture of ZnSe-CQDs(3)；(c)Time-resolved decays of the donor before(1) and after(2) the addition of the acceptor.ρ(ZnSe)=15.00 μg/mL,ρ(CQDs)=1.50 μg /mL.

2.3 能量轉(zhuǎn)移相關(guān)參數(shù)的測定

根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移機制可知，影響能量轉(zhuǎn)移效率的主要因素是供體-受體之間的距離(r)與臨界能量轉(zhuǎn)移距離(R0)。供體與受體之間能量轉(zhuǎn)移滿足下面關(guān)系[18]：

(2)

(3)

(4)

式中K2為偶極空間取向因子(K2=2/3)，N為水的折射率(N=1.33)，Φ為供體的熒光量子產(chǎn)率(Φ=0.51)，J為供體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜之間的光譜重疊積分。本實驗計算得到R0=2.54 nm，r=2.79 nm，J=4.3×10-15J/(cm3·L·moL-1)，說明ZnSe與CQDs能很好地結(jié)合，E=0.36，說明該體系具有較高的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。

2.4 DOX對ZnSe-CQDs體系的熒光猝滅作用

圖3展示了ZnSe-CQDs體系對DOX的檢測原理。由圖3可知，DOX對ZnSe和CQDs均有猝滅。ZnSe與CQDs間的FRET現(xiàn)象導(dǎo)致ZnSe的熒光降低，CQDs的熒光增強，而DOX的加入則使得體系的熒光發(fā)生有效猝滅，根據(jù)兩個熒光團之間的熒光猝滅比率(I380/I450)與DOX濃度間的線性關(guān)系可實現(xiàn)DOX的檢測。

分別考察了DOX對ZnSe、CQDs、ZnSe-CQDs體系熒光強度的影響。ZnSe、CQDs、ZnSe-CQDs對DOX的響應(yīng)范圍分別為0.025～3.20 μg/mL、0.20～12.80 μg/mL、和0.025～12.80 μg/mL。當(dāng)DOX的濃度為0.80 μg/mL時，ZnSe的熒光被猝滅了60%左右，CQDs的熒光被猝滅了30%，而ZnSe-CQDs體系中ZnSe和CQDs的熒光分別被猝滅了80%和40%左右。實驗結(jié)果表明，F(xiàn)RET的熒光放大作用賦予了體系更高的靈敏度和更寬的線性范圍。此外，F(xiàn)RET體系的構(gòu)建成功引入了兩個熒光團，為比率型熒光傳感器的構(gòu)建提供了良好的前提條件。而比率型熒光傳感器具有自我校正功能，可以提高方法的準確度[19]。

為獲得最佳的實驗效果，考察了不同溫度、pH值、緩沖溶液以及表面活性劑對ZnSe-CQDs體系的影響。結(jié)果表明，在25 ℃下，pH為7.2的Tris-HCl緩沖溶液中DOX對ZnSe-CQDs熒光猝滅效果最佳。此時，5 min內(nèi)DOX與ZnSe-CQDs即可反應(yīng)完全，而且60 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

圖3 ZnSe-CQDs體系對DOX的檢測原理Fig.3 Schemeatic display of the DOX detection via ZnSe-CQDs system

2.5 ZnSe-CQDs體系對DOX的檢測機理

采用Stern-Volmer方程考察了DOX對ZnSe-CQDs體系的熒光猝滅機理。一般而言，猝滅劑對熒光團的猝滅行為可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅[20]。靜態(tài)猝滅為猝滅劑和熒光團作用形成新的絡(luò)合物導(dǎo)致熒光猝滅，其猝滅常數(shù)(Ksv)隨著溫度的升高而降低；動態(tài)猝滅為猝滅劑和熒光團相互碰撞而導(dǎo)致熒光猝滅，其Ksv隨著溫度的升高而升高?？疾炝?88 K、298 K、308 K時DOX對ZnSe-CQDs體系中ZnSe和CQDs的熒光猝滅情況，結(jié)果如圖4(a)、圖4(b)所示。根據(jù)圖4(a)，288 K、298 K、308 K時DOX對ZnSe的Ksv分別為：2.1×107、1.9×107、1.6×107L/mol；而根據(jù)圖4(b)，在這三個溫度下DOX對CQDs的Ksv分別為：5.1×107、4.5×107、3.9×107L/mol?？梢姡珼OX對ZnSe和CQDs的猝滅的Ksv都是隨著溫度的升高而降低，屬于靜態(tài)猝滅。因此，DOX對ZnSe-CQDs的熒光猝滅可歸屬為DOX與ZnSe、CQDs上的羥基、羧基等官能團發(fā)生反應(yīng)，生成無熒光的基態(tài)化合物而導(dǎo)致體系的熒光猝滅。

圖4 不同溫度下DOX對ZnSe(a)和CQDs(b)的Stern-Volmer猝滅曲線Fig.4 Stern-volmer curves of DOX to ZnSe(a) and CQDs(b) under different temperatures c(DOX):0.00,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80 μmol/L;ρ(ZnSe)=20.00 μg/mL,ρ(CQDs)=2.00 μg /mL.

2.6 干擾實驗

2.7 工作曲線

圖5 工作曲線Fig.5 Calibration curveρ(ZnSe)=20 μg/mL,ρ(CQDs)=2.0 μg/mL,ρ(DOX):0.00,0.025,0.050,0.10,0.20,0.40,0.80,1.60,3.20,6.40,10.00 μg/mL.

在最佳實驗條件下，以FRET體系中450 nm處CQDs熒光團的熒光強度(I450)與380 nm處ZnSe熒光團的熒光強度(I380)比值(I450/I380)為Y軸，以DOX濃度為X軸，繪制工作曲線，結(jié)果如圖5所示。實驗結(jié)果表明，DOX濃度在0.025 μg/mL～10.00 μg/mL范圍內(nèi)，I450/I380值與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為I450/I380=3.68ρ+2.88，線性相關(guān)系數(shù)為r=0.9987，用3σ/k計算該方法的檢出限為7.51 ng/mL(n=11)。將本方法的線性范圍、檢出限與已發(fā)表的其他方法對比如表1所示。陶慧林等人[7]基于甲基紅和CdTe量子點之間的FRET現(xiàn)象建立了DOX的檢測方法，取得了良好的檢測效果。但是體系涉及到的甲基紅和CdTe都具有環(huán)境毒性，且該體系只是基于單一的熒光信號識別DOX，容易受環(huán)境的影響。而與甲基紅、CdTe相比，本研究涉及的CQDs和ZnSe更加綠色環(huán)保，采用雙熒光信號識別DOX，建立比率型熒光探針檢測DOX方法，可靠性更好，準確度更高。

表1 本方法與其他不同檢測方法在DOX分析中的性能對比

2.8 實際樣品檢測

采取健康新鮮尿液約20 mL于小燒杯中，靜置0.5 h后，取上清液5.00 mL裝入離心分離試管中，離心分離0.5 h，按實驗方法測定DOX的含量。結(jié)果如表2所示，方法的回收率在98.00%～106.3%之間。RSD≤6.1%(n=6)。表明所建立方法具有較高的準確度與精密度，可用于實際樣品分析。

表2 尿液中DOX的測定與加標回收實驗結(jié)果

3 結(jié)論

本文以ZnSe量子點為能量供體，CQDs為能量受體構(gòu)建對生態(tài)環(huán)境綠色友好的ZnSe-CQDs熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系，通過系列優(yōu)化實驗后建立測定鹽酸強力霉素的新方法。在最佳條件下，方法的線性范圍為0.025～10.00 μg/mL，檢出限為7.51 ng/mL。將建立的新方法用于實際樣品測定時，回收率為98.00%～106.3%。方法線性范圍寬、靈敏度高、準確度好，具有潛在的應(yīng)用價值。