徐亞萍，邱成書，伍 勇，張曉娟，梅婷婷，夏 珊，劉紅玲

(成都師范學院化學與生命科學學院，四川 成都 611130)

0 引言

紅米莧(AmaranthustricolorL.)是一種在全國各地及東南亞地區(qū)生長的保健草本植物，它的枝干及葉片中含有十分豐富的莧菜紅素；莧菜紅色素是一種易溶于水的含氮有機物，具有高抗癌、抗氧化、降血脂，保護眼睛等藥用價值[1]，與花青素不同，屬于甜菜素類；它是一種具有較高生理活性的天然色素[2]。因此，紅米莧是一種營養(yǎng)價值及其豐富的植物。目前，它的利用方式還比較單一，主要用于為蔬菜用以烹調使用或者少量用于提取莧菜紅素用作天然色素添加劑。

紅米莧的生長條件或莧菜紅素的提取條件和方法有報道[2-4]，而用其來制成酵素的研究卻甚少。為了進一步充分利用莧菜的營養(yǎng)價值，采用將紅米莧制作成酵素的方法以期賦予莧菜更好的益生功能，有助于腸胃吸收。同時產生各種風味物質，提高莧菜應用的經(jīng)濟效益，開拓莧菜廣闊的應用前景，更受到消費者的歡迎。為更好利用紅米莧，本研究以紅米莧提取液為原料，用酵母菌發(fā)酵成紅米莧酵素；測定青、紅紅米莧酵素的組分含量、相關酶活力及抗氧化活性來對比研究二者在制作成酵素的品質上面是否會有所不同，以確定最佳采摘期，以及甜菜素是否會影響酵素品質，為紅米莧酵素的制作提供研究理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

材料：紅米莧購買于永輝超市；安琪酵母(干酵母)購買于永輝超市；白砂糖(一級品)市售(購買于永輝超市)。

蘆丁(C27H30O16)乙醇(C2H6O2)；亞硝酸鈉(NaNO2)；六水合三氯化鋁(AlCl3.6H2O)；氫氧化鈉(NaOH)；沒食子酸(C7H6O5)福林試劑；碳酸鈉(Na2CO3)；Tris(C4H11NO3)；鄰苯三酚(C6H6O3)；鹽酸(HCL)；L-酪氨酸(C9H11NO3)鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6)、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺鹽(ABTS、三氯乙酸(C2HCl3O2)、水楊酸(C7H6O3)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4))、過硫酸鉀(K2S2O8)、α—二苯基—β-苦苯肼(DPPH)、甲醇(CH3OH、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、三氯化鐵(FeSO4)、硫酸亞鐵(FeSO4)：均為分析純；實驗過程中無特殊要求外，都采用蒸餾水。

1.2 儀器與設備

電子分析天平(FA2004)，常州市幸運電子設備有限公司；恒溫水浴鍋(HH-W420)，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；KDC-1044低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；pH計(PHS-3E)，上海儀電科學儀器股份有限公司；紫外分光光度計(UV754)，上海菁華科技儀器有限公司。電熱恒溫培養(yǎng)箱(YHSP-150)，上海璽恒實業(yè)有限公司；超凈工作臺(VS-840-1)，上海博訊實業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵素的制備

酵母選用干的安琪酵母、料液比1∶5、糖液比1∶5。發(fā)酵罐進行巴氏滅菌5 min、將買回的原料進行洗凈、去梗、榨汁(料液比1∶5)、過濾處理后分別裝罐(糖液比1∶5)，酵母添加量均為0.5%。青莧菜和紅莧菜的發(fā)酵罐分別設置三個重復。裝料后的發(fā)酵罐紫外滅菌24 h，在恒溫培養(yǎng)箱30℃發(fā)酵培養(yǎng)35 d：清洗、挑選→榨汁→裝料→裝罐→紫外滅菌→接種酵母菌→發(fā)酵培養(yǎng)→滅菌。

1.3.2 發(fā)酵液成分含量的測定

1.3.2.1 黃酮類化合物的測定

黃酮類化合物的測定，參照周穎等人測定方法[5]。

1.3.2.2 總酚含量的測定

紅米莧酵素中總酚含量測定參照徐輝艷等人測定的方法[6]。

1.3.2.3 莧菜紅色素含量變化的測定

參考瑪爾孜婭·阿不力米提等人的方法[7]。

1.3.3 酶活性的測定

1.3.3.1 蛋白酶活性的測定

參照邵穎等[8]測定蛋白酶活性的方法。其計算公式如下：

式中：X-莧菜酵素溶液中的酶活力(U/mL)；A-由標準曲線計算得出的酵素稀釋液的蛋白酶活力(U/mL)；4-反應試劑的總體積(mL)；n-稀釋倍數(shù)；10-反應時間為10 min，以1 min計。

1.3.3.2SOD酶活性測定

SOD酶活性測定參照沙如意等[9]采用鄰苯三酚自氧化的方法。其計算公式如下：

式中：V1-反應液總體積，mL；V2-測定樣品體積，mL；ΔA0-鄰苯三酚的自氧化速率；ΔASOD-樣品OD值變化速率；n-稀釋倍數(shù)。

1.3.4 抗氧化性的測定

1.3.4.1 還原力的測定

發(fā)酵液還原力測定參照Oyaizu[10]等方法略作修改。

1.3.4.2 羥基自由基清除能力的測定

羥自由基清除能力測定參照王小華等[11]水楊酸-硫酸亞鐵法測定。

1.3.4.3 DPPH自由基清除力的測定

參照蔣增良[12-14]等的方法測定了DPPH自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本實驗的數(shù)據(jù)處理利用SPSS.25進行數(shù)據(jù)分析，excel2010進行繪圖和數(shù)據(jù)整理。

2 結果與分析

2.1 紅米莧酵素發(fā)酵液中部分活性物質含量變化

2.1.1 紅米莧酵素黃酮類化合物含量變化

以吸光度值為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標繪制黃酮類似物標準曲線(圖1(a))，圖中可以看出：Y=13.625X-0.106，R2=0.9943，相關系數(shù)0.99714，表明標準曲線線性關系好，方法可信度高。

圖1 紅米莧酵素黃酮類化合物含量變化趨勢圖Fig.1 Change trend of flavonoids in Amaranthus tricolor extract

在同樣條件下，測定青、紅米莧酵素發(fā)酵液黃酮類似物的含量變化(圖1(b))。從圖中可以看出：發(fā)酵的前20 d內，青紅、紅紅米莧酵素發(fā)酵液中黃酮類化合物隨時間緩慢增加，增加幅度極小。第21天開始，紅米莧酵素發(fā)酵液中黃酮迅速增加，并且在第28天時候達到峰值0.0118 g/L，28天之后隨時間推移，其黃酮類似物的含量逐漸降低，到第35天與青米莧酵素發(fā)酵液黃酮含量相近。而青米莧酵素發(fā)酵液中的黃酮類似物含量在第20天達到最大值，隨后緩慢下降。在第28天左右，紅米莧酵素的黃酮類似物含量顯著高于青米莧。

2.1.2 莧菜酵素總酚含量變化

以吸光度值為縱坐標，沒食子酸濃度為橫坐標繪制總酚標準曲線(圖2(a))。圖中可以看出：Y=7.74X-0.0043，R2=0.9965，相關系數(shù)0.99824，表明標準曲線線性關系良好，方法可信度高。在與標準曲線相同條件下，測定莧菜酵素發(fā)酵液中的總酚含量(圖2(b))。從圖中可以看出：在發(fā)酵過程中，兩種莧菜酵素發(fā)酵液中，總酚含量變化十分明顯。發(fā)酵開始時紅米莧酵素發(fā)酵液中總酚含量高于青米莧酵素發(fā)酵液；0～21天期間，紅米莧酵素發(fā)酵液中總酚含量一直增加，且到21天達到峰值，21～28天期間，總酚急劇降低，28天后緩慢降低；且在21天后，發(fā)酵液中總酚含量一直低于青米莧酵素發(fā)酵液。發(fā)酵開始至第7天期間，青米莧酵素發(fā)酵液中的總酚含量幾乎沒有變化，第7天以后急劇升高，到第21天是總酚含量達到最高值，兩種酵素總酚含量差異不顯著，第21天后，發(fā)酵液中總酚含量緩慢降低；28天后則急劇下降。

圖2 紅米莧酵素總酚含量變化趨勢圖Fig.2 Change trend of total phenols in Amaranthus tricolor extract

2.1.3 紅米莧酵素中莧菜紅素含量的變化

紅米莧酵素中莧菜紅素測定結果見圖3，從圖中可知：隨發(fā)酵時間的推移，兩種莧菜酵素發(fā)酵液中的吸光度都逐漸下降，表明發(fā)酵液中的莧菜紅素含量逐漸降低，且整個發(fā)酵過程中紅米莧酵素中莧菜紅素含量在發(fā)酵過程中一直都是顯著高于青紅米莧酵素中的莧菜紅素含量。

圖3 紅米莧酵素莧菜紅素吸光度變化趨勢圖Fig.3 Change trend of amaranthine in Amaranthus tricolor extract

2.2 紅米莧酵素的酶活力的變化

2.2.1 莧菜酵素的蛋白酶活力變化

以吸光度值為縱坐標，酪氨酸濃度為橫坐標繪制蛋白酶標準曲線(圖4(a))。從圖中可以看出：Y=0.0093X-0.0939，R2=0.9993，相關系數(shù)0.99964，表明方法可靠性高。采用相同條件，測得莧菜酵素發(fā)酵液的蛋白酶含量如圖4(b)。由圖中可知：兩種米莧酵素發(fā)酵液中的蛋白酶隨發(fā)酵時間推移，都緩慢增長，發(fā)酵至35天達到最大值；且兩種米莧酵素發(fā)酵液中的蛋白酶活性相差不大。

圖4 紅米莧酵素的蛋白酶活力變化趨勢圖Fig.4 Change trend of protease activity in Amaranthus tricolor extract

莧菜酵素在發(fā)酵過程中，青紅、紅紅米莧酵素中的蛋白酶活力也隨著發(fā)酵時間變化(圖4)，由圖可知：在0～28 d的這段時間內青、紅莧菜酵素的蛋白酶活力都出現(xiàn)了穩(wěn)定的增長，在28 d之后青紅、紅紅米莧酵素的蛋白酶活力的增長速度較前段時間增長得更加迅速。在發(fā)酵的這段時間內青紅、紅紅米莧酵素的蛋白酶活力都處于增長的趨勢中，在35 d的時候達到了最大值。紅紅米莧酵素的蛋白酶活力的最大值是7.24 U/mL，青紅米莧酵素的蛋白活力的最大值是8.14 U/mL。

2.2.2 莧菜酵素的SOD酶活力的變化

根據(jù)SOD酶活性測定和計算公式，兩種米莧酵素發(fā)酵液中SOD酶活性結果如圖5。從圖中可以看出：發(fā)酵初期青紅、紅紅米莧酵素的SOD酶活力緩慢增長。紅莧菜酵素14 d～21 d快速增加，到第21天達到最大值115.93 U/mL，在21 d～35 d青莧菜呈下降趨勢。而青、紅米莧酵素在前期的時候增長緩慢，在后期的發(fā)酵過程中SOD酶活力呈緩慢下降趨勢。在64.67U/mL時青莧菜酵素的SOD酶活力達到最大值。青紅米莧酵素與紅紅米莧酵素的SOD酶活力存在較明顯差異，且紅紅米莧酵素中SOD酶活力在整個紅米莧酵素的發(fā)酵周期中都顯著高于青紅米莧酵素的SOD酶活力。

圖5 紅米莧酵素的SOD酶活力變化趨勢圖Fig.5 Change trend of SOD enzyme activity in Amaranthus tricolor extract

2.3 抗氧化活性

2.3.1 還原力

還原性是抗氧化性的一種，通過自身失去電子來具有保護其他物質不被氧化，在抗氧化活性中起重要作用[22]。

還原力是抗氧化性的一種能力，實驗的兩種米莧酵素發(fā)酵液的還原力結果如圖6。從圖中可以看出：發(fā)酵過程中，兩種發(fā)酵液的還原力與發(fā)酵開始相比，都呈增加趨勢。紅米莧酵素發(fā)酵液在0～21天期間，還原力逐漸升高，第21天達峰值；第21天之后隨發(fā)酵時間推移，逐漸降低，21～28天期間，還原力降低較明顯，而21～35天期間，還原力降低較慢；總體來看，紅米莧酵素的還原力最高值比青米莧酵素要高。發(fā)酵至第28天期間，青米莧酵素發(fā)酵液中還原力逐漸增加，變換幅度較小，到第28天達最大值；第28天之后緩慢降低。

圖6 紅米莧還原力隨時間變化趨勢對比圖Fig.6 Change trend of reducing power of Amaranthus tricolor extract

2.3.2 羥自由基清除率

采用水楊酸法測定兩種米莧酵素發(fā)酵液羥自由基清除能力，實驗結果見圖7。由圖7可以發(fā)現(xiàn)：實驗過程中所有紅米莧酵素的清除率隨時間的增長呈現(xiàn)一種先增大后減小的趨勢，青紅米莧酵素在14天取得最大的清除率，高達82.59%。相比而言，青米莧酵素發(fā)酵液羥自由基清除能力要弱不少。

圖7 紅米莧羥自由基清除率隨時間變化趨勢對比圖Fig.7 Change trend of hydroxyl radical scavenging rate of Amaranthus tricolor extract

羥自由基是生物生命活動中產生的具有非常強的電子能力的自由基，由于其反應速度快、毒性強且活性高，可導致?lián)p傷細胞膜，產生不同的疾病[23]，羥自由基清除率是采用的水楊酸法利用Fe2+與H2O2混合產生羥自由基，通過測定在反應體系中水楊酸捕捉自由基產生有色物質的吸光度來得到羥自由基清除率[24]。

2.3.3 DPPH自由基清除率

采用DPPH法測定兩種米莧酵素發(fā)酵液自由基清除能力見圖8：兩種米莧酵素的DPPH自由基清除力隨時間的增加呈現(xiàn)一種先增后減的趨勢，大約在21天達到最大值，兩個的清除率也在80%以上，青紅米莧酵素的自由基清除率為81.45% ，紅紅米莧酵素的自由基清除率為82.71%。

圖8 紅米莧DPPH清除率隨時間變化趨勢對比圖Fig.8 Change trend of DPPH scavenging rate of Amaranthus tricolor extract

3 討論與結論

3.1 討論

3.1.1 紅米莧酵素發(fā)酵液中部分活性物質含量影響

在發(fā)酵過程中，青米莧酵素與紅米莧酵素中黃酮類化合物含量達到峰值的時間不同，可能與紅米莧素提取液中存在未知組分或是同一組分含量相差太大存在密切關系，具體原因在后續(xù)研究揭示。發(fā)酵至28天時，紅米莧酵素中黃酮類化合物含量達到峰值為0.1178 mg/g；與生姜酵素中黃酮類化合物的含量[15]相似。

微生物代謝活動使發(fā)酵原材料中的結合態(tài)的酚類物質轉變?yōu)橛坞x態(tài)酚類物質，使發(fā)酵液中總酚含量升高，提高了酚類物質的產量；讓酚類物質更好被利用，提高其利用率。米莧酵素發(fā)酵液中酚類變化趨勢呈現(xiàn)先增后降趨勢，與蔣增良等研究藍莓發(fā)酵過程中藍莓“酵素”抗氧化活性的變化趨勢一致[14，16]。

3.1.2 紅米莧酵素的酶活性的影響

研究表明：超氧化物歧化酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等功效酶是植物酵素發(fā)酵液中功能活性物質[17]。提高蛋白酶活力對機體有諸多益處[18]。

青、紅米莧酵素發(fā)酵過程中酵素的蛋白酶活力都增長緩慢，在整個發(fā)酵周期中蛋白酶活力比其它研究中的植物酵素中蛋白酶活力低。可能是在對蛋白酶活力測定時過濾操作不當，樣液中含有雜質，影響了蛋白酶活力的測定。

紅紅米莧酵素在整個發(fā)酵周期中SOD酶活力都顯著高于青紅米莧酵素的SOD酶活力。SOD酶活力變化呈現(xiàn)一個先增加后降低的趨勢，紅米莧酵素在21天時達到最大值為115.9281 U/mL。

3.1.3 抗氧化活性

紅米莧酵素還原力間于0.15～0.35，表明莧菜紅素具有一定的抗氧化活性，但是未提純的天然色素含有大量雜質，是導致還原力下降的一個重要因素；此外加上發(fā)酵會產生部分活性因子，如多酚、酮類，導致還原力下降，因此是否添加酵母及青紅紅米莧原料未出現(xiàn)相關規(guī)律，在這部分還需要再進行相關的實驗探究[19]。

試驗表明：紅米莧中的莧菜紅素對羥自由基有明顯的清除效果，并且清除效果隨濃度升高而增強；在發(fā)酵14天時的酵素與有關文獻[3]提取莧菜中莧紅素測其羥自由基清除率相比，清除率更高；與黑加侖酵素[20]相比，增幅相當，最大清除率也達到90%以上。隨著發(fā)酵時間推移，酵母在酵素發(fā)酵過程中也會促進產生相關的酚類、酮類物質[3]，與發(fā)酵液中諸如莧紅素等物質相互作用形成不具生理活性接合態(tài)物質，降低了自由基清除率。

紅米莧本身中存在黃酮、多酚等物質對DPPH自由基、羥自由基有良好的清除作用，并隨濃度的增加清除效果更高[2]。紅米莧提取液含有的莧紅素極易溶出，以及發(fā)酵液中存在大量的酚類物質，莧紅素酵素對DPPH自由基有較好的清除力。在前期過程中，紅米莧酵素的清除力明顯高于青紅米莧的清除力，與羥自由基清除力相似。紅米莧酵素在發(fā)酵過程中，酵母代謝會促進青、紅米莧酵素慢慢釋放相關的酚類物質，與酵素中的莧紅素等物質相互作用，進而降低了對DPPH自由基的清除力[21]。酚類物質會在紅米莧酵素發(fā)酵過程中慢慢釋放導致酵素溶液中酚類物質的增加，進而使酵素的抗氧化活性升高，清除力變大，酚類物質在紅米莧酵素發(fā)酵進行過程中已基本溶出，溶出速率趨于平穩(wěn)，在后續(xù)發(fā)酵過程中，酵素漸漸產生其他活性物質，與其相互作用導致活性降低[3]，逐漸趨于平穩(wěn)。發(fā)酵在最初的21天內逐步增加，之后有所下降，總體趨于穩(wěn)定。與銀耳藍莓酵素相比，銀耳藍莓酵素[22]的DPPH自由基清除率在60%～85%，紅米莧酵素DPPH自由基清除率較之最大值高一些，達94%，但是最小值才20%，可能是由于莧菜紅素不穩(wěn)定，易分解造成。發(fā)酵至14天時，米莧酵素發(fā)酵液與張瑞等提取莧菜中莧紅素的DPPH自由基清除率相比，清除率更高[3]。

3.2 小結

綜合實驗研究指標發(fā)現(xiàn)發(fā)酵至21天時紅米莧酵素達到最佳狀態(tài)。對比分析青、紅米莧酵素發(fā)酵液的各項指標實驗數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)紅莧菜酵素質量更優(yōu)于青莧菜酵素質量。制備紅米莧酵素，選用紅米莧作為原材更為合理。