俞伶俐，魏升華，羅法院，文琴琴，嚴(yán)福林

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

朱砂根(ArdisiacrenataSims)是紫金?？谱辖鹋俚某＞G灌木，又名富貴籽[1]，其根部是貴州重要的道地特色民族藥材“八爪金龍”的主要來(lái)源，具有解毒消腫、活血止痛、祛風(fēng)除濕等功效，用于治療咽喉腫痛、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷等疾病[2]。除了藥用外，由于其果實(shí)紅色，果期長(zhǎng)，觀賞價(jià)值好，具有重要的園藝價(jià)值。

種子萌發(fā)是植物個(gè)體繁殖發(fā)育形成的一種復(fù)雜而重要的生物特性，成熟種子通常在適宜的環(huán)境及物質(zhì)信號(hào)的作用下開始新的生長(zhǎng)周期[3]。植物激素是一種獨(dú)特的微量信號(hào)分子，其濃度和平衡關(guān)系控制了植物在各個(gè)階段的發(fā)育，對(duì)植物種子的萌發(fā)起著關(guān)鍵性作用。外源激素處理法已成為探索種子萌發(fā)等調(diào)控機(jī)理的有效方法[4]。例如，吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)主要作用于細(xì)胞分裂和擴(kuò)張、細(xì)胞伸長(zhǎng)和分化、細(xì)胞和組織的形態(tài)建成等；赤霉素(Gibberellin，GA)能有效地促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)、種子萌發(fā)及胚根和胚軸伸長(zhǎng)生長(zhǎng)等；6-芐氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)主要作用于細(xì)胞分裂并誘導(dǎo)細(xì)胞體積橫向擴(kuò)大[5]。

近年來(lái)，由于對(duì)朱砂根研究的深入及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，使得其市場(chǎng)對(duì)朱砂根藥材的需求逐年劇增，加上藥農(nóng)的不規(guī)范的采集，使得朱砂根資源急劇下降，一些地區(qū)已難覓蹤跡。因此，開展人工引種栽培，尤其是以藥材為主的規(guī)范化、規(guī)?；耘嗥仍诿冀?。然而，種子種苗繁育是引種馴化成功的重要標(biāo)志，也是中藥材民族藥材可持續(xù)利用、規(guī)范化、規(guī)模化生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)。基于此，本研究通過(guò)探究不同外源激素對(duì)朱砂根種子生理成分的影響，探尋促進(jìn)朱砂根種子萌發(fā)的適宜激素及其水平，以提高朱砂根種子的萌發(fā)率，為朱砂根的人工種植奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試種子收集于貴州省黔東南州施秉縣、雷山縣等地，憑證標(biāo)本均由貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥栽培教研室魏升華教授鑒定，為紫金牛科朱砂根(ArdisiacrenataSims)，種子樣品及憑證標(biāo)本存放于貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥材采收加工研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

赤霉素(批號(hào)：S18001)、萘乙酸(CAS號(hào)：86-87-3)、細(xì)胞分裂素(批號(hào)：S18017)、蒽酮(批號(hào)：S19210)、磷酸二氫鈉(西隴化工股份有限公司)、乙酸乙酯(上海申博化工有限公司)等。

1.3 試驗(yàn)方法

種子前處理：對(duì)收集的朱砂根種子進(jìn)行去皮，晾干。隨機(jī)抽取種子樣品，應(yīng)用5 g/L 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)對(duì)種子進(jìn)行避光染色30 min，檢測(cè)種子的生活力。

1.3.1 時(shí)間考查

隨機(jī)選取種子54 g，用水浸泡：6 h、12 h、24 h、36 h、48 h為處理組，以未浸泡的種子為空白對(duì)照組，每組3 g，重復(fù)3次，測(cè)定其活性蛋白質(zhì)、可溶性糖、過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。

1.3.2 濃度考查

隨機(jī)選取種子60 g，處理組設(shè)置赤霉素的濃度為20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L，萘乙酸和細(xì)胞分裂素的濃度為100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L，分別浸泡24 h，純水浸泡24 h為空白對(duì)照組。分別測(cè)定其活性蛋白質(zhì)和可溶性糖的含量，過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

1.3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)考察的結(jié)果，篩選出合適的浸泡時(shí)間、激素濃度及激素種類，然后進(jìn)行L9(33)3因素3水平考察，篩選出朱砂根種子萌發(fā)的最佳方法。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)量方法

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)顯色法測(cè)定，過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定?？扇苄蕴呛坎捎幂焱壬ㄓ?30 nm波長(zhǎng)下測(cè)定[6]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法于620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定[7]。每組試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 浸種時(shí)間對(duì)朱砂根種子生理成分的影響

影響種子發(fā)芽的最重要因素為種子水分，尤其是休眠狀態(tài)下的種子對(duì)水分含量的要求更為苛刻。由表1可知，浸泡時(shí)間對(duì)朱砂根種子生理指標(biāo)的影響呈上升-下降趨勢(shì)，活性蛋白質(zhì)的含量：24 h>12 h>6 h>0 h>6 h>48 h，可溶性糖含量：24 h>12 h>36 h>6 h>48 h>0 h，過(guò)氧化氫酶活性：24 h>48 h=36 h=6 h=0 h>12 h，超氧化物歧化酶活性：24 h>48 h>36 h=12 h=6 h=0 h，浸泡24 h時(shí)的生理成分指標(biāo)相對(duì)較高；處理組和對(duì)照組比較，浸泡24 h后可溶性糖含量增加了54.95%，過(guò)氧化氫酶活性增加了50%，超氧化物歧化酶活性增加了45.56%，活性蛋白質(zhì)含量增加了3.06%。

浸泡時(shí)間對(duì)4種生理指標(biāo)的含量均有影響，但浸泡時(shí)間超過(guò)36 h會(huì)降低活性蛋白質(zhì)的含量。浸泡24 h后可溶性糖和活性蛋白含量達(dá)到最大值，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性糖和活性蛋白含量呈下降趨勢(shì)；超氧化物歧化酶在浸泡24 h后酶活性達(dá)到最大值，之后隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性降低。方差分析結(jié)果表明，浸泡時(shí)間對(duì)4種生理成分的影響具有顯著性差異(P<0.05)。經(jīng)綜合分析，本研究選擇24 h為朱砂根種子的浸種時(shí)間。

表1 浸泡時(shí)間對(duì)朱砂根種子生理活性物質(zhì)含量的影響(mg/L，x±σ)

2.2 外源激素對(duì)朱砂根種子生理指標(biāo)的影響

2.2.1 GA對(duì)朱砂根種子生理活性物質(zhì)的影響

對(duì)朱砂根種子分別用20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L濃度的GA進(jìn)行浸種24 h，測(cè)定各生理指標(biāo)情況。由表2可知，活性蛋白質(zhì)和可溶性糖隨著GA濃度的升高呈先上升后下降趨勢(shì)，在GA濃度為50 mg/L時(shí)達(dá)到最高，活性蛋白質(zhì)含量增加了9.06%，可溶性糖含量增加了22.66%；過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶隨著GA濃度的升高呈先下降后上升趨勢(shì)，超氧化物歧化酶含量降低了11.27%，過(guò)氧化物酶的含量降低了66.67%。分析結(jié)果表明，GA濃度對(duì)4種生理指標(biāo)影響顯著(P<0.05)。綜合得出GA處理濃度為50 mg/L時(shí)，各指標(biāo)綜合較高。

2.2.2 NAA對(duì)朱砂根種子生理活性物質(zhì)的影響

對(duì)朱砂根種子分別用100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L濃度的NAA進(jìn)行浸種24 h，測(cè)定各生理指標(biāo)情況。由表3可以看出，NAA不同濃度對(duì)活性蛋白質(zhì)、可溶性糖和超氧化物歧化酶含量與對(duì)照組比較均有顯著性影響，NAA能提高可溶性糖、活性蛋白含量和超氧化物歧化酶的活性，當(dāng)NAA濃度為250 mg/L時(shí)，可溶性糖和活性蛋白含量均達(dá)到最大值，當(dāng)NAA濃度為300 mg/L時(shí)，超氧化物歧化酶含量均達(dá)到最大值；分析結(jié)果表明，NAA濃度對(duì)4種生理指標(biāo)影響顯著(P<0.05)。根據(jù)生理指標(biāo)含量，綜合得出NAA處理的最佳濃度為250 mg/L。

表2 GA濃度對(duì)朱砂根種子生理活性物質(zhì)含量的影響(mg/L，x±σ)

表3 不同濃度NAA對(duì)朱砂根種子生理活性物質(zhì)含量的影響(mg/L，x±σ)

2.2.3 6-BA對(duì)朱砂根種子生理活性物質(zhì)的影響

對(duì)朱砂根種子分別用100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L濃度的6-BA進(jìn)行浸種24 h，測(cè)定各生理指標(biāo)情況。由表4可以看出，活性蛋白質(zhì)、可溶性糖的含量隨著6-BA濃度的升高呈上升-下降的趨勢(shì)；過(guò)氧化物酶活性隨著6-BA濃度的升高呈升高-下降-升高的趨勢(shì)；超氧化物歧化酶活性隨著6-BA濃度的升高呈下降-升高的趨勢(shì)。6-BA可提高活性蛋白質(zhì)、可溶性糖的含量，分別提高了19.93%、43.97%，可降低超氧化物歧化酶的活性。方差分析結(jié)果表明，6-BA濃度對(duì)4種生理標(biāo)影響顯著(P<0.05)。根據(jù)生理指標(biāo)含量，綜合得出6-BA處理的最佳濃度為250 mg/L。

表4 不同濃度6-BA對(duì)朱砂根種子生理活性物質(zhì)含量的影響(mg/L，x±σ)

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

對(duì)不同因素水平處理后，試驗(yàn)組呈現(xiàn)的結(jié)果如表5所示，不同種類、不同濃度的外源激素和處理時(shí)間都對(duì)朱砂根種子生理指標(biāo)的含量有著不同程度的影響。用50 mg/L GA處理36 h，其活性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量最高；用200 mg/L NAA處理48 h，其過(guò)氧化物酶活性最高；用60 mg/L GA處理48 h，其超氧化物歧化酶活性最高。分析結(jié)果表明，9種組合對(duì)活性蛋白質(zhì)、可溶性糖、過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶均有顯著影響(P<0.05)。

表5 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

3 結(jié)論與討論

種子萌發(fā)是其所需要的適宜溫度、水分和光照等環(huán)境因子誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)，從而引發(fā)一系列生理物質(zhì)的反應(yīng)，該過(guò)程可通過(guò)外源激素浸種等方法加以促進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)首先采用單因素考查，通過(guò)設(shè)置不同梯度的濃度和不同處理時(shí)間，探究出不同種類的激素的最適合處理濃度與最佳浸泡時(shí)間，得出朱砂根種子的最佳的浸泡時(shí)間為24 h。發(fā)現(xiàn)分別用50 mg/L GA、250 mg/L NAA、250 mg/L 6-BA處理的朱砂根種子，其活性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量最高。可溶性糖是種子萌發(fā)的呼吸底物，作為能量來(lái)源被逐漸分解[8]。蛋白質(zhì)是構(gòu)成部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是種子中氮元素的主要貯藏形式?？扇苄缘鞍灼鸬教峁┑氐闹匾饔?，也為種胚的生長(zhǎng)提供物質(zhì)能量來(lái)源[9-10]，活性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量的提高可能會(huì)促進(jìn)種子萌發(fā)。GA的最佳濃度為50 mg/L，這與曾雙的研究50 mg/L GA顯著的提高了西葫蘆種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率一致。

在P<0.05水平下，3種激素對(duì)種子的活性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量和超氧化物歧化酶活性有顯著影響，且這3種激素的各個(gè)濃度都能提高種子的活性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量，促進(jìn)種子的萌發(fā)。余春和等[12]發(fā)現(xiàn)中濃度NAA和6-BA處理對(duì)光皮樺種子的萌發(fā)有不同程度的促進(jìn)作用。杜京旗[13]發(fā)現(xiàn)6-BA具有促進(jìn)燕麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的作用。肖杰等[14]研究發(fā)現(xiàn) GA和NAA均能顯著提高3個(gè)紫薇品種種子發(fā)芽勢(shì)。趙歡蕊等[15]發(fā)現(xiàn)GA3和NAA對(duì)黃秋葵種子的萌發(fā)具有一定的促進(jìn)作用。這些發(fā)現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

在正交實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用50 mg/L GA處理朱砂根種子36 h，其活性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量最高；用60 mg/L GA處理朱砂根種子48 h，其超氧化物歧化酶含量最高；用200 mg/L NAA處理48 h，其過(guò)氧化物酶含量最高。綜合考慮，50 mg/L GA處理朱砂根種子36 h，最大的提高了4種生理生化指標(biāo)，是朱砂根種子的最佳處理方式。綜上所述，GA、NAA、6-BA對(duì)朱砂根種子的生理生化有影響，可能促進(jìn)朱砂根種子的萌發(fā)，本次實(shí)驗(yàn)為提高朱砂根種子萌發(fā)提供了一定的理論參考。