陳禮大，黎豫川，徐獻梅 ，楊元鳳，羅玉玲

(貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550025)

鹿晶益氣生血丸為復方中藥制劑，由黃芪、白芍、黨參、炙甘草、炒酸棗仁等14味中藥組成。方中黃芪味甘、性微溫，歸肺、脾經(jīng)，有補氣升陽、生津養(yǎng)血之功[1]，白芍味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)，有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗之功[2]，二者合用益氣養(yǎng)血為君藥；黨參味甘，性平，歸脾肺經(jīng)，有健脾益肺，養(yǎng)血生津之效[3]，炙甘草味甘，性平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，取其補脾和胃，益氣復脈之功[4]，炒酸棗仁味甘、酸，性平，歸肝、膽、心經(jīng)，具養(yǎng)氣補肝，寧心安神之效[5]，三藥同用輔助君藥益氣、養(yǎng)血、安神。本方具有補氣養(yǎng)血，養(yǎng)心安神之功效。主治氣虛血虧、心脾兩虛證，適用于缺鐵性貧血中醫(yī)證屬氣血虧虛證。

本方為我院血液科協(xié)定方，治療缺鐵性貧血臨床療效顯著，為方便患者服用、攜帶，研制成水丸，為臨床使用提供便利。水丸又稱水泛丸，是中藥的傳統(tǒng)劑型之一，早在《五十二病方》中就有對水丸的記載。水丸通常是由藥材細粉以水或水性液體(酒、醋、藥汁等)為黏合劑，用泛制法制成[6]。課題組參考文獻[6-7]的方法，采用單因素方差分析、正交試驗法、HPLC法等現(xiàn)代技術(shù)，研究鹿晶益氣生血丸制備工藝，為醫(yī)院制劑備案品種申報提供依據(jù)，為提高中藥傳統(tǒng)劑型水丸應用工藝與核心技術(shù)提供實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 設(shè)備與儀器

G200-Q夾層鍋(重慶市長壽湖機械制造有限公司)；2500C多功能粉碎機(永康市艾澤拉電氣有限公司)；WF-30B萬能粉碎機(江陰市雙佳機械制造有限公司)；CT-C熱風循環(huán)干燥箱(中國常州建達干燥設(shè)備有限公司)；1260infinity型HPLC儀(安捷倫科技有限公司)。

1.2 試藥

芍藥苷對照品(批號：110736-202044)來源于中國食品藥品檢定研究所；飲片均來源于貴陽濟仁堂飲片有限公司；分析甲醇(批號：67-56-1)、乙腈(批號：75-05-8)來源于Sigma-Aldrich化工試劑有限公司；磷酸(批號：20120425)來源于國藥集團化學試劑有限公司。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 處方分析

處方共14味中藥，劑量較大，為方便臨床應用，擬制備成水丸，但處方中黏性中藥較多，直接粉碎困難，且服用量大，因此對處方部分飲片進行提取，所得藥汁作為濕潤劑，另一部分進行粉粹成細粉，泛制法制丸。

2.2 考察指標選擇

本制劑制備主要分為提取工藝和成型工藝兩部分：提取工藝以出膏率為指標進行考察；成型工藝，將白芍主要藥效成分芍藥苷含量作為指標成分進行考察，同時考察起模用粉量、藥汁用量、干燥溫度、干燥時間、成型難易程度、外觀、溶散時限、重量差異等指標，優(yōu)選最佳成型工藝。

2.3 提取工藝參數(shù)考察

2.3.1 飲片吸水率考察

稱取3份提取用的處方飲片加入6倍量水浸泡，每隔一段時間觀察一次浸潤程度，待藥物浸透為止，濾過至盡，藥渣稱重，計算吸水率(%)，試驗結(jié)果見表1。

表1 藥材吸水率試驗結(jié)果Tab.1 Water absorption test results

結(jié)果可知，藥材吸水率為126.96%，結(jié)合大生產(chǎn)實際，在水提取時，確定為第一次加水時多加1.5倍量的水。

2.3.2 飲片浸泡時間考察

在滿足飲片吸水率條件下，考察浸泡時間，以總固體物收率為考察指標，優(yōu)選適宜浸泡時間。

(1)提取液制備

稱取處方中需提取部分的飲片，首次加9.5倍量水，第二次加8倍量水，考慮水煎液浸泡時間過長容易滋生細菌變質(zhì)，并結(jié)合生產(chǎn)可行性，設(shè)計浸泡0 h、0.5 h、1 h、2 h、6 h共5種樣品，煎煮2次，每次30 min，過濾，合并濾液，藥液定溶至250 mL，備用。

(2)總固體物收率測定

精密移取提取液25 mL，各兩份，至已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥，參照文獻[10]，計算總固體物收率，運用spss23軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表2、表3、表4。

表2 浸泡時間對出膏率的影響(%)Tab.2 Influence of soaking time on paste yield

結(jié)果：單因素方差分析表明p<0.05，說明不同的浸泡時間對出膏率有顯著性差異；而因素多重比較結(jié)果表明浸泡時間0 h與0.5 h、1 h，無顯著差異，與浸泡2 h、6 h出膏率有顯著性差異。浸泡2 h和6 h無顯著性差異。因此，確定浸泡時間為2 h。

表3 浸泡時間對出膏率單因素方差分析表Tab.3 Single factor ANOVA of soaking time on paste yield

表4 浸泡時間對出膏率因素多重比較結(jié)果Tab.4 Multiple comparison results of soaking time on paste yield

2.3.3 提取工藝參數(shù)正交試驗

按照正交試驗設(shè)計考察煎煮次數(shù)、煎煮時間、加水量三個影響煎煮效果的主要因素，按每個因素3水平，用L9(34)正交表安排試驗(表5)。以出膏率為指標對提取工藝進行評價，優(yōu)選最佳工藝條件，結(jié)果見表6、表7。

表5 因素水平表Tab.5 Factor-level table

表6 提取工藝條件L9(34)正交試驗安排及直觀分析結(jié)果Tab.6 L9(34)orthogonal test arrangement and results of extraction conditions

表7 提取工藝條件L9(34)正交試驗方差分析結(jié)果Tab.7 L9(34)orthogonal test variance analysis results of extraction conditions

結(jié)果可知：各因素對出膏率的影響為A>C>B，A因素不同水平差異較大，最佳方案為A3C3B1；但是從方差分析結(jié)果可見三個因素均無顯著性差異，因此選擇方案A3B1C1為最佳提取工藝。結(jié)合吸水率及浸泡時間結(jié)果，確定提取工藝為：飲片浸泡2 h，煎煮3次(首次加7.5倍量水，2、3次加6倍量水)煎煮時間30 min。

2.4 成型工藝考察

2.4.1 藥汁用量考察

按提取工藝制備藥汁3份，分別濃縮至密度1.10、1.20、1.30，備用。另取3份剩余處方量飲片混合粉碎過100目篩，混勻。以5%細粉起模、成型、蓋面、干燥、選丸，即得成品，以成品成型程度、外觀、成品量、溶散時限、重量差異作為指標篩選藥汁密度，結(jié)果見表8。

表8 藥汁用量對外觀、成品量、溶散時限、重量差異的影響Tab.8 Influence of decoction amount on the appearance，weight， dissolution time and weight difference of the finished product

(1)重量差異

參照文獻[9]中方法，以10丸為1份，取供試品10份，分別稱定重量，再與平均重量比較，重量差異為±10%，超出重量差異限度的不得多于2份，并不得有1份超出限度1倍。

(2)溶散時限測定

取供試品6丸，選擇孔徑為1.0 mm的篩網(wǎng)，參照崩解時限檢測法[9]進行檢查，本品應在1 h內(nèi)全部溶散；操作過程中如供試品黏附擋板妨礙檢查時，應另取6丸，以不加擋板進行檢查，上述檢查，應在規(guī)定時間內(nèi)全部通過篩網(wǎng)，如有細小顆粒狀物未通過篩網(wǎng)，但已經(jīng)軟化且無硬心者可按符合規(guī)定論。

結(jié)果可知：藥汁密度1.10泛丸易成型但容易粘連；藥汁密度1.30泛丸不易成型且色澤不均勻、重量差異不符合規(guī)定；藥汁密度1.20易成型，色澤均勻，溶散時限、重量差異均符合規(guī)定，因此確定藥汁濃縮密度為1.20。

2.4.2 起模用粉量考察

分別以3%、7%細粉量進行起模，以水丸的成型、外觀、成品量、溶散時限及重量差異作為考察指標。結(jié)果見表9。

表9 起模細粉量篩選結(jié)果Tab.9 Screening results of fine powder amount

結(jié)果可知：3%的細粉起模不易成型，色澤不均勻，重量差異不符合規(guī)定；7%細粉起模，不易成型，色澤不均勻，重量差異不符合規(guī)定；5%細粉起模易成型，粒度適宜，色澤均勻，溶散時限及重量差異均符合規(guī)定，因此確定以5%細粉起模。

2.4.3 成型樣品品干燥時間考察

以芍藥苷含量、外觀、水分、溶散時限為指標，設(shè)置溫度為80℃，考察干燥時間(1 h、2 h、3 h)對成型樣品的影響。

(1)干燥時間對芍藥苷含量影響

1)對照品溶液的制備

取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含60 μg的溶液，即得。

2)供試品溶液的制備

取供試品約1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加稀乙醇20 mL超聲處理(240 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3)芍藥苷含量測定

參照文獻[10]，采用HPLC法對芍藥苷含量進行測定，色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)為流動相；檢測波長為230 nm，理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應不低于2000。結(jié)果見表10、圖1。

表10 干燥時間對芍藥苷含量影響Tab.10 Influence of drying time on paeoniflorin content

圖1 不同干燥時間HPLC圖Fig.1 HPLC diagrams of different drying time

(2)干燥時間對外觀、水分、溶散時限的影響

將樣品至干燥箱內(nèi)，設(shè)置溫度為80℃，分別于干燥后1 h、2 h、3 h取樣，考察外觀、水分、溶散時限。結(jié)果見表11。

表11 干燥時間對外觀、水分、溶散時限的影響Tab.11 Influence of drying time on the appearance， moisture and dissolution time of the finished product

以上結(jié)果可知，干燥時間分別在1 h、2 h、3 h條件下，成型樣品芍藥苷含量、外觀、水分、溶散時限均無明顯差異，干燥時間在1 h，水分超標，因此優(yōu)選干燥時間為2 h。

2.4.4 成型樣品干燥溫度考察

取樣品三份置于干燥箱中分別設(shè)置溫度為60℃、70℃、80℃進行干燥，2 h后取出，以芍藥苷含量、外觀、水分、溶散時限為指標，考察干燥溫度對成型樣品的影響。

(1)干燥溫度對芍藥苷含量影響

按照2.4.3項下方法測定芍藥苷含量，結(jié)果見表12，圖2。

表12 干燥溫度對芍藥苷含量的影響Tab.12 Influence of drying temperature on paeoniflorin content

(2)干燥溫度對外觀、水分、溶散時限的影響

將樣品至干燥箱內(nèi)，分別設(shè)置60℃、70℃、80℃，于干燥后2 h取樣，考察外觀、水分、溶散時限。結(jié)果見表13。

圖2 不同干燥溫度HPLC圖Fig.2 HPLC diagrams at different drying temperatures

表13 干燥溫度對外觀、水分、溶散時限的影響Tab.13 Influence of drying temperature on the appearance， moisture and dissolution time of the finished product

以上結(jié)果可知：干燥溫度(60℃、70℃、80℃)下樣品外觀、溶散時限均符合要求，芍藥苷含量明顯變化，水分分別為11.5%、8.3%、6.2%。因此，優(yōu)選80℃作為該工藝的干燥溫度。

2.5 小試工藝參數(shù)驗證

根據(jù)以上研究結(jié)果，初步確定鹿晶益氣生血丸的生產(chǎn)工藝為：取處方中需提取飲片浸泡2 h，煎煮3次(首次加7.5倍量水，2、3次加6倍量水)煎煮時間30 min，過篩，合并濾液濃縮至相對密度1.20，作為潤濕劑備用；另取處方剩余飲片混合粉碎過100目篩，得細粉混勻；取5%細粉與潤濕劑起模，泛丸成型，0℃干燥2 h，選丸，即得。采用該工藝生產(chǎn)三批小試樣品，檢測成品的外觀、水分、溶散時限、重量差異、芍藥苷含量，驗證生產(chǎn)工藝參數(shù)。結(jié)果見表14、表15、圖3。

表14 鹿晶益氣生血丸小試樣品檢測結(jié)果Tab.14 Appearance test results of Lujing Yiqi Shengxue pills

表15 三批小試樣品芍藥苷檢測結(jié)果Tab.15 Detection results of paeoniflorin in three batches of small-scale test samples

圖3 三批小試樣品HPLC圖Fig.3 HPLC diagrams of three batches of small-scale test samples

由以上結(jié)果可知： 三批小試樣品外觀、水分、溶散時限、重量差異、芍藥苷含量參數(shù)，檢測結(jié)果穩(wěn)定與工藝研究數(shù)據(jù)相符，證明該工藝簡便、穩(wěn)定可控，有利于工藝生產(chǎn)。

3 結(jié)論與討論

通過鹿晶益氣生血丸生產(chǎn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)工藝研究，優(yōu)選出最佳工藝參數(shù)，并進行了工藝參數(shù)驗證，結(jié)果顯示該工藝簡便、穩(wěn)定可控，可用于制劑生產(chǎn)，為該品種申請醫(yī)院制劑備案批件，奠定了實驗基礎(chǔ)。

工藝研究中，處方中黃芪含纖維較多，粉碎困難，用于提取，藥汁黏性過大，在成型過程中不易分散，且細粉量與藥汁比例懸殊較大，故應對黃芪的提取和粉碎所占比例進行深入研究。后期應對包衣、包裝工藝等參數(shù)進行研究，確保成品質(zhì)量穩(wěn)定可控。