周冉豪 秦 銘 王 睿*

(1.貴州省檢測技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽 550014; 2.貴陽幼兒師范高等?？茖W(xué)校，貴州 貴陽 551400)

赤霉酸(Gibberellic acid)，化學(xué)名稱為(3S，3aR，4S，4aS，7S，9aR，9bR，12S)-7，12-二羥基-3-甲基-6-亞甲基-2-氧全氫化-4a，7-橋亞甲基-9b，3-橋亞丙烯基薁并[1，2-b]呋喃-4-羧酸，其結(jié)構(gòu)式見圖1。它是一種廣譜低毒植物生長調(diào)節(jié)劑，是植物體內(nèi)普遍存在的五大內(nèi)源激素之一，能促進(jìn)作物細(xì)胞分裂與生長，促使植物生長發(fā)育，使植株增高、葉片增大，打破種子、塊莖和鱗莖等器官的休眠，促進(jìn)發(fā)芽，提高結(jié)果率或無核果實(shí)結(jié)實(shí)率，在棉花、水稻、馬鈴薯、水果、蔬菜等作物上廣泛使用[1，2]。

圖1 赤霉酸結(jié)構(gòu)式

雷琪等[3]和王娟等[4]對赤霉酸與其他有效成分的復(fù)配制劑進(jìn)行了高效液相色譜測定研究，吳愛娟等[5]和程華鵬等[6]也利用高效液相色譜儀對多種植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行了同時(shí)測定。利用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測赤霉酸的方法也有報(bào)道[7]。但對于含赤霉酸單一成分制劑的檢測暫無報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)在參照赤霉酸相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)推薦方法[8]的基礎(chǔ)上，對20%赤霉酸可溶粉劑中的有效成分進(jìn)行定性及定量測定，按照農(nóng)藥登記管理中對檢測方法的要求，將各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)逐一進(jìn)行了驗(yàn)證，該方法操作簡單，擁有良好的分離效果和線性關(guān)系，且精密度和準(zhǔn)確度均符合要求，適用于企業(yè)生產(chǎn)質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和溶液

甲醇，色譜純，F(xiàn)isher Chemical；磷酸，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Milli-Q超純水；磷酸水溶液，V水∶V磷酸=2 000∶1；赤霉酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，含量99.2%，上海市農(nóng)藥研究所有限公司；20%赤霉酸可溶粉劑、赤霉酸原藥(含量90%)、制劑空白，重慶市諾意農(nóng)藥有限公司。

1.2 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，具有PDA檢測器，色譜柱：Extend-C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；Empower色譜數(shù)據(jù)處理工作站；METTLER TOLEDO XSE205DU型電子天平；默克密理博超純水系統(tǒng)。

1.3 高效液相色譜操作條件

流動(dòng)相：V甲醇∶V磷酸水溶液=35∶65；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：210 nm。保留時(shí)間：赤霉酸約為8.8 min。標(biāo)樣與試樣典型色譜圖見圖2、圖3。

圖2 赤霉酸標(biāo)樣色譜圖

圖3 20%赤霉酸可溶粉劑色譜圖

1.4 測定步驟

1.4.1 標(biāo)樣溶液的配制

稱取0.1 g赤霉酸標(biāo)樣于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，超聲振蕩5 min，冷卻至室溫，搖勻，得到赤霉酸的標(biāo)樣儲備溶液；再用流動(dòng)相將該儲備溶液稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4.2 試樣溶液的配制

稱取含赤霉酸約0.05 g的20%赤霉酸可溶粉劑于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，超聲振蕩5 min，冷卻至室溫，搖勻，過濾。

1.5 測定

在1.3的色譜條件下，連續(xù)分析標(biāo)樣溶液，當(dāng)前后兩針峰面積相對變化小于1.5%時(shí)，按照標(biāo)樣、試樣、試樣、標(biāo)樣的進(jìn)樣順序開始分析。

1.6 計(jì)算

試樣中赤霉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X1(%)按下式計(jì)算：

式中：A1為標(biāo)樣溶液中赤霉酸峰面積的平均值；A2為試樣溶液中赤霉酸峰面積的平均值；m1為赤霉酸標(biāo)樣的質(zhì)量，g；m2為赤霉酸試樣的質(zhì)量，g；ω為標(biāo)樣中赤霉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；f為稀釋因子，值為1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

將PDA檢測器的檢測波長調(diào)整為波長掃描范圍為190～400 nm，對赤霉酸標(biāo)樣進(jìn)行掃描(掃描結(jié)果見圖4)。由于赤霉酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)中沒有能產(chǎn)生強(qiáng)紫外吸收的基團(tuán)，故選取不受甲醇等溶劑截止波長干擾的210 nm為檢測波長。在該波長下，赤霉酸受到的干擾相對較少，靈敏度相對較高。

圖4 赤霉酸紫外吸收曲線

選用Extend-C18柱，在1.3的高效液相色譜條件下，赤霉酸與雜峰分離較好，峰型尖銳對稱，能夠得到較好的分析結(jié)果。

2.2 特異性測定

采用HPLC-PDA掃描進(jìn)行測定，赤霉酸(保留時(shí)間8.8 min)，峰“純度角”始終小于“閾值”，表示該峰在此區(qū)域具有光譜一致性，色譜峰純度圖見圖5。

圖5 20%赤霉酸可溶粉劑中赤霉酸峰純度圖

2.3 線性相關(guān)性測定

在1.3的色譜條件下，將1.4.1中的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)分析2次，取平均值。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、赤霉酸峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到赤霉酸的線性方程為y=9.07×103x-6.34×104，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，校正曲線見圖6。

圖6 校正曲線圖

2.4 非分析物干擾測定

在1.3的高效液相色譜條件下，對制劑空白、赤霉酸原藥逐一進(jìn)行高效液相色譜分析(圖7)，分析結(jié)果顯示，目標(biāo)分析物能被有效分離，制劑空白和原藥在目標(biāo)分析物出現(xiàn)的區(qū)域無干擾峰存在，見圖7。

圖7 非分析物干擾測定圖譜：制劑空白(A)和赤霉酸原藥(B)

2.5 分析方法的精密度

準(zhǔn)確稱取5個(gè)供試物，在1.3的色譜條件下進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。20%赤霉酸可溶粉劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定的變異系數(shù)為0.42%，小于Horwitz公式的計(jì)算值1.72%，說明該分析方法的精密度符合質(zhì)量控制的要求。

表1 分析方法的精密度測定結(jié)果

2.6 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)

稱取約0.2 g制劑空白于100 mL容量瓶內(nèi)，按20%赤霉酸可溶粉劑中赤霉酸的含量，加入相應(yīng)赤霉酸原藥，再用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，超聲振蕩5 min，冷卻至室溫，搖勻，平行操作5次，得到準(zhǔn)確度試驗(yàn)溶液。在1.3的色譜條件下進(jìn)行測定，得到赤霉酸的回收率范圍為98.88%～100.57%，平均回收率為99.32%(結(jié)果如表2所示)，說明該方法有良好的準(zhǔn)確度。

表2 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究中作者參照國家標(biāo)準(zhǔn)對20%赤霉酸可溶粉劑中赤霉酸進(jìn)行液相色譜分析，該方法方便、快速，分離效果好，線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度等各項(xiàng)方法學(xué)驗(yàn)證指標(biāo)均符合要求，可用于原藥或制劑中赤霉酸的定量分析及質(zhì)量控制。