陳旭 龔紹慧 余斌 詹劍
缺血性腦卒中是由于腦部血管阻塞引起腦組織缺血、缺氧,造成腦組織損傷,嚴重者對患者腦部神經(jīng)功能造成嚴重的影響,主要表現(xiàn)為偏癱、語言、感覺等障礙[1-2]。降低因缺血缺氧導致的神經(jīng)損傷是腦神經(jīng)領(lǐng)域研究的熱點,目前認為線粒體在缺血性腦卒中的神經(jīng)細胞恢復(fù)方面發(fā)揮重要作用,但其作用機制復(fù)雜,尚無確切定論[3]。線粒體是生物氧化及能量轉(zhuǎn)換的重要場所,其中線粒體酶系在線粒體功能的發(fā)揮中至關(guān)重要,α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體(α-KGDHC)是其中重要的一員,是調(diào)節(jié)有氧代謝中的速度酶[4-5]。相關(guān)研究認為,α-KGDHC活性能夠影響腦組織的能量代謝,當其活性較低時,會造成腦組織損傷,影響腦的正常功能[6]。同樣有研究證實,α-KGDHC 對于腦組織中活性氧的濃度具有一定的調(diào)節(jié)作用[7]。α-KGDHC 能夠作為轉(zhuǎn)琥珀酰酶,發(fā)揮調(diào)節(jié)琥珀?;揎椀淖饔?,有研究表明,抑制α-KGDHC 活性能夠降低線粒體蛋白質(zhì)的琥珀?;瑥亩鴾p輕缺血再灌注的組織損傷[8]。因此推測α-KGDHC 與缺血性腦卒中具有一定的聯(lián)系。目前關(guān)于α-KGDHC 酶活性及琥珀?;揎棇θ毖阅X卒中的研究較少,本研究對其影響及作用機制進行探究。
1.1 實驗動物 雄性SD 大鼠,級別:清潔級,數(shù)量:50 只,周齡:8 周齡,體重:187~223 g,平均(203±15)g,由山西省醫(yī)科大學提供,許可證為[生產(chǎn)許可SCXK(晉)2019-0004],經(jīng)動物倫理委員會批準。
1.2 主要材料與儀器 3-甲基-2-氧代戊酸(KMV)(CAS:1460-34-0,生產(chǎn)廠家:上海源葉生物科技有限公司,規(guī)格:5 g);戊巴比妥鈉(CAS:57-33-0,生產(chǎn)廠家:上海易匯生物科技有限公司,規(guī)格:5 g);紅四氮唑(CAS:298-96-4,生產(chǎn)廠家:北京凱詩源生物科技有限公司,規(guī)格:500 g);α-KGDHC酶聯(lián)免疫試劑盒(上海一基實業(yè)有限公司,貨號:YJ000643);小動物動脈夾(上海玉研科學儀器有限公司,型號:Y501-08 型),小動物腦血流儀(上海玉研科學儀器有限公司,型號:LAB);酶標儀(奧地利Infinite 公司,型號:200 Pro);蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析儀(北京百泰派克生物科技有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 模型建立及分組 從50 只雄性清潔級大鼠中隨機選取10 只作為Sham 組(僅分離頸動脈,不結(jié)扎),其余大鼠通過結(jié)扎頸動脈建立腦缺血模型。所有大鼠均進行麻醉處理(2%戊巴比妥鈉,30 mg/kg),將大鼠固定后對頸部進行消毒,沿頸部中線做一切口,分離肌肉組織后剝離出頸內(nèi)、外動脈及頸總動脈,采用動脈夾將頸總動脈夾閉,并結(jié)扎頸外動脈,將尼龍線栓插入頸內(nèi)動脈,當繼續(xù)插入感受到阻力時停止并固定,取下動脈夾,阻塞腦中動脈建立腦缺血模型。整個操作過程進行大鼠腦部血流量監(jiān)測,腦缺血建模成功標注:線栓插入完全后,血流量下降超過20%。
35 只大鼠腦缺血模型建立成功,并隨機分為NR 組、AR 組、NR+3-甲基-2-氧代戊酸(KMV)組各9 只,AR+KMV 組8 只,各組再進行再灌注處理。
再灌注:所有大鼠缺血0.5 h 后抽出線栓,NR操作為:直接取出線栓后縫合,完全開放腦血流量,15 min 后處死,AR 操作為采用動脈夾,控制為開放1/2 腦血流量退出線栓并縫合,0.5 h 后處死。腦缺血再灌注建模成功標準:線栓取出后,腦血流量上升至基線的70%(10 min 內(nèi))。35 只大鼠均成功建立再灌注模型(術(shù)中應(yīng)維持大鼠核心體溫)。
1.3.2 藥物處理 根據(jù)人與實驗動物藥物劑量換算公式[9],NR+KMV 組、AR+KMV 組均于缺血后腹腔注射給予10 μL 的KMV(0.2 mol/L),其余組給予等量的生理鹽水。
1.3.3 大鼠腦組織α-KGDHC 活性檢測 所有大鼠麻醉處理后迅速處死,取損傷腦組織,置于液氮中冷凍保存,加入適量緩沖液,研磨成勻漿,低溫離心(5 000 r/min,15 min)收集上清液,采用α-KGDHC 酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測,加入反應(yīng)混合液反應(yīng)5 min,記錄340 nm 波長激發(fā)后,460 nm發(fā)射熒光的光密度值,計算α-KGDHC 活性。
1.3.4 大鼠腦梗區(qū)域占比情況 取各組凍存的腦組織,于切片模具中制作腦組織切片(2 mm),將切片置于2% 紅四氮唑溶液中染色0.5 h,染色完成后與黑色背景下拍照并觀察,采用scionimage 軟件分析計算梗死面積,白色區(qū)域為梗死面積,紫紅色為非梗死區(qū)域。腦梗區(qū)域占比=梗死體積/總體積×100%。
1.3.5 蛋白質(zhì)琥珀?;兓闆r 采用免疫沉淀-質(zhì)譜分析線粒體檢測蛋白質(zhì)琥珀酰基表達量,各組取部分凍存腦部位,研磨成勻漿后加入裂解液,裂解腦組織、細胞,低溫下使用超聲探針進行沖擊(沖擊3 次,每次間隔15 s),離心后取上清液,置于EP 管中,加入蛋白酶抑制劑,冰上反應(yīng)5 min,將蛋白質(zhì)稀釋至200 μg/mL,加入稀釋好的賴氨酸琥珀?;贵w(稀釋比1∶200),再加入20 μL/mL的蛋白A 瓊脂糖磁珠,低溫孵育過夜,洗滌后進行洗脫,并對所得肽段進行LC/MS/MS 分析。
1.4 統(tǒng)計學處理 利用SPSS 19.0 軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以()表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD-t 檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
各組α-KGDHC 活性經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與Sham 組比較,NR 組α-KGDHC 活性低(P<0.05);與NR 組比較,AR組α-KGDHC 活性高,NR+KMV 組α-KGDHC活性低(P<0.05);與AR 組比較,AR+KMV 組α-KGDHC 活性低(P<0.05);各組腦梗區(qū)域占比經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與Sham 組比較,NR 組腦梗區(qū)域占比高(P<0.05);與NR 組比較,AR 組腦梗區(qū)域占比低,NR+KMV組腦梗區(qū)域占比高(P<0.05);與AR 組比較,AR+KMV 組腦梗區(qū)域占比高(P<0.05);各組賴氨酸琥珀酰基表達量經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與Sham 組比較,NR 組賴氨酸琥珀?;磉_量低(P<0.05);與NR 組比較,AR 組賴氨酸琥珀酰基高,NR+KMV 組賴氨酸琥珀?;磉_量低(P<0.05);與AR 組比較,AR+KMV 組賴氨酸琥珀?;磉_量低(P<0.05)。見表1。
表1 大鼠腦組織α-KGDHC活性水平、腦梗區(qū)域占比及賴氨酸琥珀?;磉_量比較()
表1 大鼠腦組織α-KGDHC活性水平、腦梗區(qū)域占比及賴氨酸琥珀?;磉_量比較()
*與Sham 組比較,P<0.05;#與NR 組比較,P<0.05;△與AR 組比較,P<0.05。
缺血性腦卒中由于腦部血管堵塞導致腦組織缺氧缺血,即使在及時的治療下恢復(fù)血液流通,依舊會對腦組織造成一定的損傷,因此近年來學者致力于降低缺血再灌注對于腦組織的損傷[10-11]。目前認為缺血再灌注損傷是由于缺血、缺氧導致線粒體功能受損,并產(chǎn)生大量的氧自由基,當其濃度過高時會誘導細胞凋亡或壞死,從而導致腦組織損傷[12-13]。因此,保護線粒體功能是改善缺血再灌注的重點。α-KGDHC 是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶,而三羧酸循環(huán)是線粒體功能的重要部分,是氧自由基的生成的重要途徑[14-15]。因此α-KGDHC 活性對于改善缺血性腦卒中的適應(yīng)性再灌注具有研究意義。
本研究顯示,與Sham 組比較,NR 組α-KGDHC活性及賴氨酸琥珀?;磉_量低,腦梗區(qū)域占比高,表明缺血后再灌注會降低α-KGDHC,減少琥珀酰化,腦損傷面積增加。原因為腦缺血缺氧后有氧代謝受阻,氧化磷酸化過程無法正常進行,但三羧酸循環(huán)依舊能進行,產(chǎn)生大量還原型輔酶,在α-KGDHC 的作用下生成H2O2,而H2O2則會反向抑制α-KGDHC 活性,導致α-KGDHC 降低[16-17]。當再灌注后,雖恢復(fù)氧供給,但三羧酸循環(huán)受損,恢復(fù)較慢,另外缺血時還會產(chǎn)生大量的次黃嘌呤,再灌注時,在氧的作用下生成黃嘌呤并釋放氧自由基,進一步抑制α-KGDHC 活性[18-19]。AR 則會減輕部分腦損傷,增加α-KGDHC 活性及賴氨酸琥珀?;揎棧砻飨噍^于NR,AR 對于腦組織具有一定的保護作用,其作用機制可能與α-KGDHC 活性的增加有關(guān)。能夠逐步增加氧供給,使三羧酸循環(huán)逐步恢復(fù),減少還原型輔酶的堆積,同時減少氧自由基的產(chǎn)生,降低對α-KGDHC 活性的抑制作用[20]。為證實AR 通過α-KGDHC 活性對腦組織的保護作用,本研究通過加入α-KGDHC 活性抑制劑KMV,結(jié)果顯示,在NR 的基礎(chǔ)上給予KMV 則會抑制α-KGDHC 活性及賴氨酸琥珀酰化修飾,增加腦梗面積,在AR 的基礎(chǔ)上給予KMV 同樣會抑制α-KGDHC 活性及賴氨酸琥珀?;揎?,增加腦損傷,該結(jié)論進一步證實AR 對于腦組織的保護作用與α-KGDHC 活性有關(guān)。而α-KGDHC 能夠作為轉(zhuǎn)琥珀酰酶發(fā)揮作用,當α-KGDHC 活性較高的情況下能夠促進賴氨酸琥珀酰化修飾。
綜上所述,α-KGDHC 酶活性及琥珀酰化修飾能夠改善缺血性腦卒中的AR 的損傷,對大鼠腦組織具有保護作用。