朱文娟，石麒麟，夏慧，張曉嵐，朱亞平，胡丕偉

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其是消化系統(tǒng)中第六大常見的惡性腫瘤[1]。膽囊癌存在種族和地理差異，在西方國家發(fā)病比較少見，但在南美、東歐、東南亞中部國家或地區(qū)相對多見[2]，特別是在中國、印度及日本等國家多發(fā)。由于其起病隱匿，惡性程度高，起病常處于晚期，因此預(yù)后較差。Gremlin1蛋白是一種促血管生長因子，是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）的拮抗劑，是一種具有重要生物學(xué)意義的調(diào)節(jié)劑，因其在組織細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，近年來被發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、炎癥反應(yīng)和侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。本研究分析Gremlin1在膽囊癌不同臨床病理學(xué)參數(shù)中的差異，探討其在膽囊癌組織中的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月至2021年11月在浙江省湖州市第一人民醫(yī)院進(jìn)行膽囊手術(shù)后確診為膽囊癌的75例患者，所有患者手術(shù)前均未接受放療、化療及靶向治療等抗腫瘤治療，且無其他消化道腫瘤病史。另選取20例正常膽囊標(biāo)本納入正常組，其中男6例，女14例。所有標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，制備4 m連續(xù)切片。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.2 方法 免疫組織化學(xué)研究采用En-Vision二步法，組織經(jīng)連續(xù)切片，烤片、脫蠟、水化，3%H2O2封閉，高壓鍋抗原修復(fù)，加入一抗（Gremlin1、Ki-67均購自Abcam公司）過夜，DAB顯色、蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗作為空白對照，Gremlin1以結(jié)腸癌組織作為陽性對照，Ki-67以正常扁桃體組織作為陽性對照。

1.3 結(jié)果 判定由本院兩名資深病理科?？漆t(yī)生獨立進(jìn)行評估，每張切片隨機(jī)選取5個視野（×200），閱片前不知道臨床數(shù)據(jù)和病理結(jié)果。計數(shù)并判斷染色程度，半定量積分法判定結(jié)果。染色程度評分：（1）不染色為0分；（2）輕度染色，淺黃色1分；（3）黃色2分；（4）顏色較深，棕黃或棕褐色3分。染色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞的百分率判定：（1）＜5%記0分，（2）5%～25%記1分，（3）26%～50%記2分，（4）＞50%記3分。以陽性細(xì)胞染色比例與程度評分相乘結(jié)果：0～1分 為陰性，2～3分為弱陽性，4～6分為中度陽性，7～9分為強(qiáng)陽性。將染色陰性和弱染色定義為陰性組，將中等和強(qiáng)染色定義為陽性組[3]。Ki-67在膽囊癌細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，計算陽性染色的腫瘤細(xì)胞核占總的腫瘤細(xì)胞占的百分比，≥20%認(rèn)為是陽性，＜20%為陰性[4]。

1.4 隨訪 于2022年1月通過電話隨訪患者治療、有無化療、生存及復(fù)發(fā)等情況。

1.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用2檢驗，采用Kaplan-Meier法對隨訪資料進(jìn)行生存分析，采用Log-rank檢驗各組生存率之間的差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床及病理資料 75例膽囊癌患者中，男21例，女54例；中位年齡69歲。術(shù)前臨床診斷膽囊炎和/或膽囊結(jié)石38例，診斷為膽囊占位或膽囊腫物36例，診斷為梗阻性黃疸1例。術(shù)后病理證實腺癌為主73例，1例黏液腺癌，1例腺鱗癌；病灶周圍合并上皮內(nèi)瘤變23例，未合并上皮內(nèi)瘤變52例；0～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期22例。

2.2 膽囊癌及正常組織中Gremlin1的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示Gremlin1在部分膽囊癌及正常膽囊組織中均有表達(dá)（封三彩圖5）。Gremlin1在膽囊癌中的陽性率為50.67%（38/75），在膽囊正常組織中的陽性率為15.00%（3/20）。

圖5 Gremlin1在部分膽囊癌及正常膽囊組織中的表達(dá)

2.3 膽囊癌中Gremlin1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 膽囊癌及正常膽囊組織Gremlin1表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同年齡、性別之間Gremlin1表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），而在淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、有無合并上皮內(nèi)瘤變中Gremlin1表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 膽囊癌中Gremlin1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

2.4 Kaplan-Meier生存分析 結(jié)果顯示Gremlin1表達(dá)陽性的膽囊癌患者的存活時間明顯短于Gremlin1表達(dá)陰性的患者，見圖1。

圖1 陰性組與陽性組Kaplan-Meier生存分析

3 討論

Gremlin1由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌，可以與BMP-2、4、7直接通過胱氨酸結(jié)合[5-7]，從而阻斷BMP與其相應(yīng)受體結(jié)合形成拮抗作用的一種分泌型蛋白。早期研究中，人們主要認(rèn)識到Gremlin1通過BMP/Smad信號通路在胚胎發(fā)育、器官及骨骼生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。近年來，隨著BMP/Smad信號通路在腫瘤領(lǐng)域的作用被認(rèn)知，特別是在腫瘤診治和骨轉(zhuǎn)移中的新認(rèn)知，作為BMP/Smad通路拮抗劑的Gremlin1越來越被更多人認(rèn)識，并開展深入研究[8]。此外，Stabile等[9]發(fā)現(xiàn)作為BMP拮抗劑Dan家族成員，Gremlin1被確定為一種新型血管內(nèi)皮生長因子激動劑，可以與靶內(nèi)皮細(xì)胞直接相互作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成，這種新穎而重要的能力被認(rèn)為是一種新的、以前未被認(rèn)識的能力，Gremlin1蛋白在人類腫瘤血管生成發(fā)育中起重要作用[10]?？傊?，Gremlin1被認(rèn)為是癌癥中的一種新型致癌或促血管生成因子。BMP通路是在腫瘤進(jìn)程中具有雙重作用[11]，因為它具有促進(jìn)腫瘤和抑制腫瘤的雙重活性，具體取決于癌細(xì)胞類型、腫瘤微環(huán)境和腫瘤生長階段。因此，Gremlin1的表達(dá)水平與腫瘤預(yù)后的關(guān)系可能會因為不同組織、不同病理類型、不同腫瘤微環(huán)境及腫瘤生長階段不同而出現(xiàn)截然不同的結(jié)果。大多數(shù)研究顯示Gremlin1水平在多個腫瘤及其基質(zhì)中過度表達(dá)，并且Gremlin1過表達(dá)與腫瘤分期、預(yù)后密切相關(guān)，包括結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌及膽管細(xì)胞癌等[12-14]。與對照受試者相比，大多數(shù)人類惡性間皮瘤組織中的mRNA和蛋白質(zhì)水平均顯示出升高[15]。

Gremlin1的表達(dá)與多種腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)，因此，有研究者提出Gremlin1可能是癌癥中一個有前途的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點。但Gremlin1在膽囊癌中的表達(dá)始終未見報道。而眾所周知，膽囊癌是一種罕見的侵襲性惡性腫瘤，從診斷初起中位生存期較短，總體預(yù)后較差。有效的治療包括早期發(fā)現(xiàn)和手術(shù)治療。盡管治療仍主要是手術(shù)治療，但局部治療和基于分子醫(yī)學(xué)的定向治療等較新的方式已讓晚期疾病患者的預(yù)后得到改善。提高對膽囊癌變的病理分子機(jī)制的了解對于完善診斷、預(yù)后以及為晚期膽囊癌惡性腫瘤患者開發(fā)新的靶向治療非常重要[16]。本研究使用免疫組織化學(xué)研究了正常膽囊及膽囊癌Gremlin1蛋白的表達(dá)，Gremlin1在膽囊癌中的分布模式與正常膽囊上皮細(xì)胞相似；膽囊癌組織中Gremlin1蛋白表達(dá)明顯增多，Gremlin1陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期，合并上皮內(nèi)瘤變有關(guān)（均P＜0.05），總之與膽囊癌預(yù)后相關(guān)。同時本研究也發(fā)現(xiàn)Gremlin1表達(dá)陽性的膽囊癌患者的存活時間明顯短于陰性患者，這證實Gremlin1可能是膽囊癌預(yù)后的一個參考指標(biāo)。Wu等[14]在肝外膽管細(xì)胞癌中也有類似發(fā)現(xiàn)，Gremlin1表達(dá)陽性的肝外膽管癌存活時間明顯短于陰性者，陽性表達(dá)是患者獨立不良預(yù)后因素。

綜上所述，Gremlin1是與癌癥發(fā)展相關(guān)的多個過程的關(guān)鍵參與者，包括增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Gremlin1在膽囊癌細(xì)胞中的表達(dá)升高表明Gremlin1可能在膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，具體參與機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。