楊寶蓮，吳建華，廖洲青

（江西省贛州市中醫(yī)院制劑室，贛州 341000）

新甲傷藥膠囊源于贛州市中醫(yī)院院長(zhǎng)、骨傷科主任連育才副主任中醫(yī)師及其團(tuán)隊(duì)的經(jīng)驗(yàn)方“傷科中藥散”，因其在治療跌打損傷、瘀血腫痛、傷筋動(dòng)骨等方面療效顯著，確定為醫(yī)院協(xié)定處方。

此方是由三七、紅花、當(dāng)歸、醋乳香、醋沒藥、仙茅、煅自然銅、肉桂等中藥材組成的復(fù)方制劑，在之前的臨床使用過程中，均是以原藥材研粉后直接吞服，難以對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效控制，且在使用保管上極為不便。

本研究旨在中醫(yī)理論和現(xiàn)代藥學(xué)質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（Qualityby Design，QbD）理念的指導(dǎo)下，對(duì)該自擬粉劑，開展生產(chǎn)工藝的研究并制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用HPLC法對(duì)處方中的主要活性成分三七建立質(zhì)量控制方法，以確保該制劑在臨床應(yīng)用中的質(zhì)量穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 儀器：Agilent1200高效液相色譜儀（四元泵，紫外檢測(cè)器）、Agilent Chemistation化學(xué)工作 站、Mettler toledo電子分析天平、Kq3200de超聲清洗儀。對(duì)照品：人參皂苷Rb1（批號(hào)：110704-202028）、人參皂苷Rg1（批號(hào)：110703-202034）、三七皂苷R1（批號(hào)：110745-201921），以上對(duì)照品來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院。樣品：新甲傷藥膠囊（自制，批號(hào)20200603）。試劑：乙腈為色譜純、水為超純水，其余試劑為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：安捷倫C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；外標(biāo)法。

表1 色譜梯度洗脫

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品、三七皂苷R1對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg10.2 mg、人參皂苷Rb10.2 mg、三七皂苷R1 0.05 mg的混合溶液，搖勻，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率360 W，頻率40 kHz）20分鐘，放冷，再稱定重量，用水飽和的正丁醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，加氨試液洗滌2次（15 mL，10 mL），取正丁醇液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4 缺三七陰性溶液的制備 取缺三七陰性樣品，照供試品溶液的制備方法同法制成缺三七的陰性溶液。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺三七陰性溶液各10 μL注入液相色譜儀，用流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1～圖6。

圖1 人參皂苷Rg1對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

圖2 人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

圖3 三七皂苷R1對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

圖4 混合對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

圖5 供試品溶液HPLC色譜圖

結(jié)果：由圖可見，人參皂苷Rg1保留時(shí)間約30分鐘，人參皂苷Rb1保留時(shí)間約57分鐘，三七皂苷R1保留時(shí)間約27分鐘，與其它各峰達(dá)到基線分離，缺三七陰性無(wú)干擾，理論塔板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算在4000以上，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.2 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品（含三七皂苷R10.300 mg/mL、人參皂苷Rg10.753 mg/mL、人參皂苷Rb10.755 mg/mL）2 mL、3 mL、5 mL、10 mL、20 mL至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成濃度分別為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂 苷Rb1（0.0240 mg/mL、0.0602 mg/mL、0.0604 mg/mL；0.0360 mg/mL、0.0904 mg/mL、0.0906 mg/mL；0.0600 mg/mL、0.1506 mg/mL、0.1510 mg/mL；0.1200 mg/mL、0.3012 mg/mL、0.3020 mg/mL；0.2400 mg/mL、0.6024 mg/mL、0.6040 mg/mL）的5個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，按擬定色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品的濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得三七皂苷R1回歸方程Y=1880.9X-2.5488，R2=0.9993；人參皂苷Rg1回歸方程Y=2618.6X-19.423，R2=0.9991；人參皂苷Rb1回歸方程Y=2098.5X-27.182，R2=0.9993。見表2和圖7~圖9。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

圖7 三七皂苷R1線性關(guān)系圖

圖8 人參皂苷Rg1線性關(guān)系圖

圖9 人參皂苷Rb1線性關(guān)系圖

結(jié)果：三七皂苷R1進(jìn)樣濃度在0.0240 mg/mL～0.2400 mg/mL，人 參 皂 苷Rg1進(jìn) 樣 濃 度 在0.0602 mg/mL～0.6024 mg/mL，人參皂苷Rb1濃度在0.0604 mg/mL～0.6040 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，見表3。結(jié)果RSD均小于2%，精密度良好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的樣品 （批號(hào)：20200603），按上述供試品溶液制備方法，平行制備供試品溶液共6份，依法測(cè)定，計(jì)算含量，見表4。結(jié)果RSD均小于2%，重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按樣品測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24小時(shí)后進(jìn)樣測(cè)定，見表5。結(jié)果RSD均小于2%，供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的新甲傷藥膠囊（批號(hào)：20200603，每1g含三七皂苷R11.32 mg、人參皂苷Rg13.97 mg、人參皂苷Rb12.59 mg）6份，各1 g，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品適量，按供試品溶液的制備方法制備加樣回收樣品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，見表6~表8。結(jié)果RSD均小于2%，回收率良好。

表6 三七皂苷R1加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表7 人參皂苷Rg1加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表8 人參皂苷Rb1加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.7 耐用性試驗(yàn) 取批號(hào)20200603樣品進(jìn)行耐用性試驗(yàn)，分別在不同流速、不同柱溫、不同色譜柱條件下測(cè)定人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的總含量，見表9~11。結(jié)果表明，在不同流速、柱溫和色譜柱條件下樣品的含量測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，RSD均小于2%，耐用性好。

表9 耐用性流速試驗(yàn)

表10 耐用性柱溫試驗(yàn)

表11 耐用性色譜柱試驗(yàn)

2.8 樣品含量測(cè)定 取三批新甲傷藥膠囊中試樣品，按正文所述的方法測(cè)定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的總量，見表12。

表12 樣品含量測(cè)定結(jié)果

2.9 樣品含量限度的確定 中試樣品所用三七中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的總量為5.91%，水分為7.0%，三批中試樣品人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的總量的轉(zhuǎn)移率分別為95.95%、96.36%、95.55%，平均轉(zhuǎn)移率為95.95%?！吨袊?guó)藥典》[1]2020年版一部收載三七，規(guī)定飲片水分不得過14.0%，含量按干燥品計(jì)算，含人 參 皂 苷Rg1（C42H72O14）、人 參 皂 苷Rb1（C54H92O23）及三七皂苷R1（C47H80O18）的總量不得少于5.0%。本品每粒膠囊含三七0.043 g，按90%轉(zhuǎn)移率計(jì)算，每粒膠囊中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的總量為1.664 mg。故擬確定本品中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的含量限度為：本品每粒含三七以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的總量計(jì)，不得少于1.7 mg。三批中試樣品均符合規(guī)定。

2.10 結(jié)論 通過方法學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)考察，均符合中藥指導(dǎo)原則的要求，說(shuō)明該方法可操作性強(qiáng)、專屬性好、準(zhǔn)確度及精密度高且穩(wěn)定性可靠，可以作為本品中三七含量測(cè)定方法。

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)的選擇 新甲傷藥膠囊為三七、紅花等十六味制成的中藥復(fù)方制劑，總方活血化瘀、消腫止痛、接骨生肌，用于跌打損傷、瘀血腫痛、傷筋動(dòng)骨、扭傷等。三七具有散瘀止血、消腫定痛的功效，為本方君藥，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1為三七有效成分[2]，故擬將人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1作為本品的含量指標(biāo)，并采用HPLC法測(cè)定其總量[3-6]。

3.2 提取溶液的選擇 在測(cè)定皂苷類成分含量時(shí)，我們先后采用了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、水飽和的正丁醇等數(shù)種提取液，結(jié)果顯示，除本文所述方法外，其它試液萃取過程繁瑣、主成分提取量少而雜質(zhì)成分多，樣品也不易蒸干，最終造成誤差大難以控制。而本文所采用的方法簡(jiǎn)便易行、提取效率高，實(shí)際檢測(cè)中，色譜峰也能達(dá)到很好的分離。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的化學(xué)結(jié)構(gòu)接近，其理化性質(zhì)也基本相似，故有相似的色譜響應(yīng)。紫外掃描發(fā)現(xiàn)，三者在200~210 nm之間有較大的吸收峰，尤其在203 nm處其響應(yīng)值最為明顯，參照相關(guān)文獻(xiàn)，最終確定203 nm為本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)。