丁 穎，朱先鵬，李江波，劉 爽，于清平，王 琳*

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院/人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 130062；2.吉林金梓源生物科技有限公司，吉林 四平 136400；3.吉林省遼源市西安區(qū)農(nóng)林水利工程總站，吉林 遼源 136200；4.吉林省柳河縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，吉林 通化135300；5.吉林省通化縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，吉林 通化134100)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)屬于革蘭陽性菌，能夠引發(fā)大范圍的獲得性感染[1-2]。近年來，由于抗生素的廣泛使用及使用過程中存在的不規(guī)范操作，使得多藥耐藥菌株愈發(fā)增多。目前，死于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus,MRSA)感染的患者人數(shù)已經(jīng)超過死于艾滋病病毒感染的人數(shù)[3-4]。然而，目前治療和控制MRSA的方案卻非常有限[5]，因此針對MRSA的新型治療藥物的開發(fā)就顯得愈發(fā)迫切[6]。國際研究委員會研討會上提及的特異性中和細菌毒力因子以提高先天免疫系統(tǒng)對致病菌清除的方法即抗毒力策略越來越引起大家的關(guān)注[7]。

病原菌的毒力因子通常與細菌的生長無關(guān)，而是經(jīng)病原菌產(chǎn)生、分泌后幫助病原菌在各種條件下生存，因此針對不同的毒力因子找尋新的抑制劑成為研究熱點。葡萄黃素(staphyloxanthin，STX)是S.aureus的一個重要毒力因子，從S.aureus感染者分離的菌種中90%均可產(chǎn)生STX。STX是S.aureus的一種膜結(jié)合類胡蘿卜素，隨著不同菌種毒力呈現(xiàn)不同程度的黃色，主要呈現(xiàn)為淡橙紅色或金黃色，其生物結(jié)構(gòu)已經(jīng)被闡明[8]。研究表明，STX可以保護S.aureus免受氧化應(yīng)激傷害。CLAUDITZ等[9]研究了STX與活性氧物質(zhì)(ROS)的相互作用，證明STX可通過其共軛雙鍵清除自由基。由于STX位于細胞膜上，它可能主要保護脂質(zhì)，但也可能參與保護蛋白質(zhì)和DNA。STX生物合成需要經(jīng)過異戊二烯途徑由焦磷酸法尼基合成酶(IspA)[10]合成法尼基二磷酸作為底物，底物被脫水鯊烯合成酶(CrtM)、脫水鯊烯脫氫酶(CrtN)、氧化酶(CrtP)、還原酶(AldH)、糖基轉(zhuǎn)移酶(CrtQ)和脂肪酰轉(zhuǎn)移酶(CrtO)等一系列酶催化修飾后最終生成[11]。通過對野生型和等位基因crtM突變體的比較分析表明，野生型對過氧化氫、超氧自由基、羥基自由基、單線態(tài)氧和中性粒細胞殺傷作用的抵抗力以及在宿主體內(nèi)的適應(yīng)性和生存能力都比突變菌更強[9]。另據(jù)報道，萘替芬能夠通過競爭性抑制STX生成途徑中脫水鯊烯脫氫酶(CrtN)的作用而抑制STX的產(chǎn)生，并可在小鼠模型中有效降低多種S.aureus的毒力，抑制MRSA的感染[12]。

目前，國內(nèi)外針對STX抑制劑的研究主要集中在化學(xué)藥物。中藥小分子藥物取材天然，作用平穩(wěn)，毒副作用小。本研究是從實驗室提取的中藥醇提取物中篩選STX的有效抑制劑，發(fā)現(xiàn)補骨脂醇提取物抑制效果最好，對其主要成分的抑制活性的分析發(fā)現(xiàn)其中幾種單體成分都可以有效抑制STX的產(chǎn)生，其中補骨脂二氫黃酮甲醚的色素抑制作用尤為明顯，因此本試驗對該單體的抑制活性和機制進行了進一步的探討。補骨脂二氫黃酮甲醚屬于異戊烯基黃酮類化合物，具有抗炎、平喘、抗氧化以及抗腫瘤等多種藥理作用[13]。本試驗結(jié)果證實了補骨脂二氫黃酮甲醚能夠通過抑制STX生物合成中的關(guān)鍵基因的表達降低MRSA菌株的致病力，為開發(fā)治療MRSA感染的藥物提供了新的理論指導(dǎo)和先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 菌株與主要試劑S.aureus菌株USA300、Newman、ATCC 29213由吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)分子藥理學(xué)實驗室保存；中藥提取物由本實驗室制備并保存；TSB培養(yǎng)基購自青島海博有限公司；中藥材購自重慶市金乾農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；補骨脂二氫黃酮甲醚(Lot：drk-1842-950423，CAS NO：19879-30-2)，純度>98%，購自成都德銳可生物科技有限公司；甲醇(分析純)購自北京化學(xué)試劑公司；甲醇(色譜純)和乙腈(色譜純)購自Dikma公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；超高靈敏CCK-8檢測試劑盒購自上海尚寶生物科技有限公司。

1.2 補骨脂的醇提稱取20 g中藥補骨脂成熟干燥種子粉碎后的粉末置于圓底燒瓶中，向燒瓶中加入120 mL 100%甲醇溶液并混勻。使用冷凝回流裝置加熱萃取，回流2 h，過濾并收集萃取液，重復(fù)2次。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至40 mL，轉(zhuǎn)移至坩堝中攪拌加熱蒸發(fā)水分，最后將黏稠樣品置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中持續(xù)干燥最終獲得補骨脂醇提取物浸膏。

1.3 STX抑制劑的篩選將耐藥S.aureus與藥物共培養(yǎng)后，通過觀察色素生成多少來從中藥醇提物中篩選有效抑制劑。USA300菌株過夜培養(yǎng)物按照1∶100比例接種于2 mL TSB培養(yǎng)基中，加入中藥醇提物至終質(zhì)量濃度為16 mg/L，設(shè)置僅接種USA300并加入等量DMSO組作為對照，培養(yǎng)36 h，12 000 r/min 離心1 min后，通過菌體沉淀顏色觀察抑制效果。

1.4 STX抑制定量試驗使用有機溶劑萃取法萃取STX后通過測定吸光度確定色素含量。過夜培養(yǎng)USA300菌株1∶100比例接種于4 mL TSB培養(yǎng)基中，加入不同質(zhì)量濃度的待測藥物補骨脂醇提取物(終質(zhì)量濃度分別為0.25,1.00,4.00,16.00 mg/L)及補骨脂二氫黃酮甲醚(終質(zhì)量濃度分別為0.25,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,16.00,32.00 mg/L)，設(shè)置僅接種菌株并加入等量DMSO組為對照。恒溫搖床37℃、180 r/min培養(yǎng)36 h，12 000 r/min 離心1 min 收集培養(yǎng)物棄上清，觀察菌體沉淀顏色。使用0.01 mol/L PBS洗滌菌體2次，棄洗滌液，用1 mL甲醇分3次重懸菌體萃取色素。將3次萃取液混合，12 000 r/min 離心1 min使藥渣等雜質(zhì)沉淀，每管萃取液樣品取200 μL于96孔板中，450 nm波長處測定吸光值并繪制曲線，并通過GraphPad Prism 8.0軟件計算抑制劑的IC50。該試驗重復(fù)3次。

1.5 補骨脂醇提取物及補骨脂二氫黃酮甲醚最小抑菌濃度(MIC)及生長曲線的測定

1.5.1最小抑菌濃度(MIC)的測定 MIC按照臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)中所述的微量肉湯稀釋法進行。在96孔培養(yǎng)板的每1行的2～11孔中加入100 μL干凈的培養(yǎng)基，第1孔中加入質(zhì)量濃度為1 024 mg/L的待測中藥單體母液(DMSO<0.5%)，將體積補至200 μL混勻，從第1孔吸取100 μL 液體加入到第2孔中混勻后，取100 μL液體加入到第3孔中，以此類推倍比稀釋。以只加入肉湯培養(yǎng)基的孔作為陰性對照，以只加入DMSO的組為陽性對照。每種待測樣品進行3次平行試驗。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金葡菌USA300菌液調(diào)節(jié)菌量至1×108CFU(D600 nm=0.1)加入到各個孔中，而后將96孔板放入37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以抑制細菌生長的最小濃度為該藥物的最小抑菌濃度。

1.5.2生長曲線的測定 過夜培養(yǎng)的USA300菌株按1∶100的比例在TSB培養(yǎng)基中擴培，生長至D600 nm=0.3時分裝于40 mL小錐形瓶中，加入不同質(zhì)量濃度補骨脂醇提取物及補骨脂二氫黃酮甲醚，設(shè)置不加藥物對照，恒溫搖床37℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，每個樣品每隔1 h取1 mL菌液，使用紫外分光光度計測D600 nm值，記錄數(shù)據(jù)并繪制曲線。

1.6 高效液相色譜(HPLC)檢測利用HPLC檢測補骨脂醇提取物中抑制色素有效成分的含量，使用色譜純甲醇溶解補骨脂醇提取物(20 g/L)及單體補骨脂二氫黃酮甲醚(100 mg/L)，用薄膜過濾器過濾后上樣。色譜條件：色譜柱為C18-WR(4.6 mm×250 mm，5 μm，WondaSil公司)，流動相組成：水(A泵)、乙腈(B泵)、甲醇(C泵)作為洗脫液進行梯度洗脫。程序設(shè)定：程序1時間設(shè)定0～10 min，乙腈(B泵)濃度變化10%→35%，甲醇(C泵)濃度變化80%→30%，洗脫液其他成分用水(A泵)調(diào)整補足；程序2時間設(shè)定10～30 min，乙腈(B泵)濃度變化35%→37.5%，甲醇(C泵)濃度變化30%→25%，洗脫液其他成分用水(A泵)調(diào)整補足；程序3時間設(shè)定30～40 min，乙腈(B泵)濃度變化37.5%→40%，甲醇(C泵)濃度變化25%→20%，洗脫液其他成分用水(A泵)調(diào)整補足。流速設(shè)置為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為30 μL；檢測波長設(shè)置為254 nm。

1.7 過氧化氫敏感性試驗過夜培養(yǎng)USA300菌株1∶100接種于2 mL TSB培養(yǎng)基中，加入藥物至質(zhì)量濃度為0.5，2.0，8.0 mg/L，設(shè)置等量DMSO組作為溶劑對照，恒溫搖床37℃、轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)24 h。取500 μL菌液離心，收集菌體，使用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌2次，加入500 μL PBS重懸混勻菌體。吸取少量菌液加至1 500 μL PBS緩沖液中調(diào)整D600 nm=0.1，取250 μL調(diào)整好菌液于2 mL 離心管中，加入30%H2O2溶液至終濃度為1.5%，封口膜密封，37℃恒溫箱中孵育1 h。另取菌液250 μL加入等量無菌PBS作對照。孵育后菌液加入5 μL 20 000 U/mL無菌過氧化氫酶終止反應(yīng)。取100 μL反應(yīng)液至900 μL PBS中，取10 μL稀釋液點至TSA平板上進行菌落計數(shù)。試驗重復(fù)3次。

1.8 細菌酸堿刺激存活試驗過夜培養(yǎng)USA300菌株1∶100擴培至50 mL TSB培養(yǎng)基中，生長至D600 nm為1.0時，擴培分裝至加入補骨脂二氫黃酮甲醚(8 mg/L)或等量DMSO溶劑對照組的酸性TSB肉湯(pH5)、堿性TSB肉湯(pH9)及正常TSB(pH7)肉湯中，每8 h使用紫外分光光度計測定D600 nm值，通過繪制生長曲線測定細菌的生長情況。所有試驗重復(fù)3次。

1.9 CCK-8細胞活性試驗采用CCK-8法測定補骨脂二氫黃酮甲醚的細胞毒性。取對數(shù)生長期的A549細胞，以20 000細胞/孔接種200 μL于96孔板中，于5%CO2、恒溫37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞貼壁后，更換含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，并分別加入補骨脂二氫黃酮甲醚至終質(zhì)量濃度1，2，4，8 mg/L于各孔中，設(shè)置溶劑DMSO及空白培養(yǎng)基作為對照，每個劑量設(shè)置3孔平行重復(fù)。恒溫細胞培養(yǎng)箱37℃孵育6 h，每孔吸出100 μL上清培養(yǎng)液，在各孔加入10 μL CCK-8溶液，于37℃恒溫箱孵育1 h，用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度，與不加藥僅加入培養(yǎng)基對照組數(shù)值比較，計算相對細胞活性。

1.10 細胞黏附試驗在24孔板中每孔接種2×105個A549細胞，并加入1 mL含有10%胎牛血清的 DMEM高糖培養(yǎng)基，放入5%CO2、恒溫37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，更換培養(yǎng)基混合USA300(MOI=20)感染細胞，并分別加入終質(zhì)量濃度1，2，4，8 mg/L的補骨脂二氫黃酮甲醚，設(shè)置DMSO對照，恒溫箱37℃孵育2 h。使用0.01 mol/L 無菌PBS緩沖液清洗細胞3次，加入1 mL無菌蒸餾水裂解細胞5 min，稀釋涂板，37℃恒溫箱中孵育12 h后記錄平板上菌落數(shù)并進行統(tǒng)計分析。所有試驗進行3次重復(fù)。

1.11 RT-PCR過夜培養(yǎng)USA300菌株按照1∶100接種于含4 mL TSB培養(yǎng)基的試管中，加入補骨脂二氫黃酮甲醚(8 mg/L)，設(shè)置等量DMSO作對照，恒溫搖床37℃，轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)物12 000 r/min離心5 min收集菌體沉淀，加入Tris-HCL(pH8.0)200 μL重懸菌體，95℃金屬浴加熱20 min。待自然冷卻后加入50 μL 1 g/L溶菌酶混勻，置于37℃水浴鍋中5 h破壞細胞壁。加入1 mL TRIzol振蕩混勻，冰浴5 min，加入200 μL預(yù)冷的氯仿渦旋15 s混勻，冰浴5 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，管中液體分3層，小心吸取上層水相600 μL于無核酸酶1.5 mL EP管中，加入600 μL 預(yù)冷異丙醇振蕩混勻，冰浴10 min，4℃、12 000 r/min 離心10 min棄去管中液體，此時RNA經(jīng)離心已經(jīng)吸附至管壁及管底，加入1 mL使用DEPC水配置的75%乙醇洗滌沉淀，4℃、7 500 r/min離心 5 min，小心棄凈上清，室溫晾干5 min，加入20 μL DEPC水溶解RNA沉淀。通過吸光度比率(D260 nm/D280 nm)定量，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)NCBI上相關(guān)基因序列設(shè)計引物(表1)進行RT-PCR擴增，每個反應(yīng)重復(fù)3次。引物均由生工生物(上海)股份有限公司合成。結(jié)果采用相對定量法(2-ΔΔCt)分析。

表1 引物信息

1.12 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用GraphPad Prism 8.0和SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。單因素方差分析用于STX抑制定量試驗、過氧化氫敏感性試驗、細菌酸堿刺激存活試驗、細胞活性試驗、細胞黏附試驗、RT-PCR各組間的差異；以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果

2.1 多重耐藥S.aureusSTX抑制劑篩選為了使抑制劑的篩選更準確高效，首先考察了不同菌株STX生成量隨培養(yǎng)時間的變化(圖1A)，選用色素產(chǎn)生明顯的USA300菌株作為研究對象，并將篩選STX抑制劑與菌株共培養(yǎng)時間確定為36 h。通過對本實驗室制備并保存的中藥材提取物庫進行篩選，在中藥材醇提物中，發(fā)現(xiàn)16 mg/L的補骨脂醇提物的色素抑制效果最為明顯(圖1B)。

A.不同金葡菌生成STX量隨時間變化；B.16 mg/L中藥提取物抑制USA300菌株STX生成情況

2.2 補骨脂醇提物中多種成分抑制STX產(chǎn)生中藥材提取物成分復(fù)雜，據(jù)文獻報道補骨脂提取物中含有補骨脂素、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂定、補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂酚等主要成分[14-15]。本試驗通過對補骨脂醇提物(圖2A)及其主要成分對STX的抑制作用的分析，發(fā)現(xiàn)其中補骨脂二氫黃酮甲醚對STX的抑制活性最為明顯(IC50=0.529 mg/L)(圖2B)。隨后，通過高效液相色譜法檢測了補骨脂二氫黃酮甲醚在補骨脂醇提物中的含量，為1.83%(圖2C，D)。如上所述，本試驗選擇補骨脂二氫黃酮甲醚作為后續(xù)研究的目標化合物。

A.不同質(zhì)量濃度補骨脂提取物對STX的抑制活性；B.不同質(zhì)量濃度補骨脂二氫黃酮甲醚對STX的抑制活性；C.補骨脂二氫黃酮甲醚標準品高效液相色譜圖(254 nm)；D.補骨脂醇提取物高效液相色譜圖(254 nm)。與不加藥對比，ns示差異不顯著(P>0.05)，**示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 補骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株生長的影響為了測定補骨脂醇提物及有效單體成分補骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株生長的影響，本試驗進行了MIC試驗和生長曲線的測定。結(jié)果顯示，補骨脂醇提物對USA300菌株24 h的MIC為32 mg/L，補骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株24 h的MIC大于512 mg/L。如圖3所示，補骨脂醇提物及補骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株的生長未產(chǎn)生顯著影響，雖然高質(zhì)量濃度的補骨脂二氫黃酮甲醚在早期抑制菌株生長，但很快恢復(fù)至與正常菌株相同的生長速度。以上結(jié)果證明補骨脂二氫黃酮甲醚在有效抑制STX的質(zhì)量濃度下不會對細菌生長產(chǎn)生影響。

圖3 不同濃度補骨脂醇提物(A)及補骨脂二氫黃酮甲醚(B)對金葡菌USA300生長的影響

2.4 補骨脂二氫黃酮甲醚對MRSA氧敏感性的影響葡萄黃素是一種抗氧化色素，為了進一步確證補骨脂二氫黃酮甲醚對葡萄黃素的抑制作用，本試驗使用H2O2作為氧化劑對USA300菌株進行殺傷刺激。如圖4A所示，氧敏感性試驗結(jié)果顯示，與未加補骨脂二氫黃酮甲醚對照組相比，藥物組USA300菌株對氧化劑殺傷更敏感，且其敏感性呈現(xiàn)劑量依賴性變化，即隨著補骨脂二氫黃酮甲醚劑量增加，USA300菌株對過氧化氫的敏感性增加，存活率降低。

2.5 補骨脂二氫黃酮甲醚對MRSA在酸堿脅迫刺激環(huán)境中的影響STX分布在S.aureus細胞膜上對病原菌產(chǎn)生保護作用，因此本試驗進一步考察了STX除抗氧化性質(zhì)外，在酸堿脅迫刺激環(huán)境中對USA300菌株存活的影響。由圖4B可知，補骨脂二氫黃酮甲醚處理后的USA300菌株在酸性培養(yǎng)基(pH5.0)中對環(huán)境刺激的抵抗力下降(P<0.05)，而堿性培養(yǎng)基(pH9.0)中與對照組(pH7.0)差異并不顯著(P>0.05)，表明補骨脂二氫黃酮甲醚能夠恢復(fù)耐藥S.aureus對酸刺激的敏感性。

A.補骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株氧敏感性影響,與對照組相比，*示差異顯著(P<0.05)，**示差異極顯著(P<0.01)；B.補骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株酸堿環(huán)境抗逆性影響，與不加藥組相比，**示差異極顯著(P<0.01)，ns示差異不顯著(P<0.05)。下同

2.6 補骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株感染A549細胞的影響為了檢測補骨脂二氫黃酮作為抗菌藥物的安全性，首先檢測其對細胞生長是否影響，由圖5A可知，補骨脂二氫黃酮甲醚在抑制STX的有效質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對A549細胞活性沒有影響(P>0.05)。結(jié)果2.2證明補骨脂二氫黃酮甲醚質(zhì)量濃度在8 mg/L時對STX生產(chǎn)的抑制率可達90%以上，且藥物在8 mg/L時及以下并未對A549細胞活性造成影響。

細菌對宿主細胞的黏附是其侵入并感染細胞的前提，如圖5B所示，隨著補骨脂二氫黃酮甲醚質(zhì)量濃度升高，細胞表面黏附菌量逐漸降低。質(zhì)量濃度4 mg/L 補骨脂二氫黃酮甲醚即可顯著降低USA300菌株對A549細胞的黏附能力，從而保護A549細胞不被細菌侵襲。

與對照組相比，無*或ns示差異不顯著(P>0.05)

2.7 補骨脂二氫黃酮甲醚對STX生成途徑相關(guān)基因的調(diào)控為了探究補骨脂二氫黃酮甲醚的作用機制，在轉(zhuǎn)錄水平上，本試驗通過RT-PCR檢測8 mg/L補骨脂二氫黃酮甲醚對MRSA STX生成相關(guān)基因表達的影響。與空白溶劑DMSO處理組相比，補骨脂二氫黃酮甲醚處理組葡萄黃素生成途徑中重要基因crtM、crtN、crtP、crtQ、crtO及葡萄黃素上游異戊二烯合成途徑相關(guān)基因ispA的表達水平均明顯降低(P<0.01)(圖6)，表明補骨脂二氫黃酮甲醚可能是通過抑制STX生成通路相關(guān)基因的表達從而表現(xiàn)出對其活性的抑制作用，進而阻止耐藥S.aureus對細胞的黏附。

圖6 補骨脂二氫黃酮甲醚對葡萄黃素生成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平影響

3 討論

隨著多重耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，病原菌耐藥性成為全球不得不面對的一大挑戰(zhàn)，抗生素研發(fā)速度遠遠落后于耐藥菌株的頻繁迭代[16]。近年來以毒力因子為靶標，在不對病原菌產(chǎn)生生存壓力的同時，通過機體免疫系統(tǒng)的協(xié)助清除病原菌的抗毒力策略引發(fā)國際社會的廣泛關(guān)注。本研究旨在從實驗室現(xiàn)有的植物提取物中篩選出S.aureusSTX的有效抑制劑，并對其抑制機制進行初步的探討。

STX是S.aureus標志性毒力因子之一，其產(chǎn)生受溫度，光照，時間等影響，藥物篩選過程中為了保證STX產(chǎn)生穩(wěn)定且易于觀察，選擇色素產(chǎn)生明顯的菌株USA300，并根據(jù)色素隨時間變化的曲線將收集色素的時間確定在36 h。因為葡萄黃素產(chǎn)生后眼觀可見，所以本試驗通過觀察菌體顏色的變化能夠快速高效的篩選出STX的抑制劑。本試驗對實驗室提取的中藥醇提物進行篩選，發(fā)現(xiàn)補骨脂醇提物具有顯著的色素抑制作用，但中藥提取物成分構(gòu)成復(fù)雜，且存在難以準確定量及后續(xù)機制研究困難等問題，因此結(jié)合現(xiàn)有報道[14]，通過對補骨脂醇提物分析，成功找到對STX有明顯抑制效果的補骨脂二氫黃酮甲醚。該化合物在較低質(zhì)量濃度下(IC50=0.529 mg/L)就有很顯著的色素抑制活性，8 mg/L 的藥物就能達到90%的抑制率，且在該質(zhì)量濃度水平下不影響USA300菌株的生長，不易引發(fā)S.aureus產(chǎn)生耐藥性。

STX分布在S.aureus表面保護S.aureus免受宿主免疫機制的影響。在體外通過檢測USA300菌株應(yīng)對脅迫刺激條件的存活情況考察補骨脂二氫黃酮甲醚是否能有效降低耐藥S.aureus的防御力。氧化劑H2O2刺激及酸堿環(huán)境脅迫生長結(jié)果均表明藥物處理使USA300菌株對不良刺激更敏感，有望通過抑制色素降低病原菌自身對刺激的抵抗能力，提高其對機體免疫殺傷的敏感性進而使病原體更易被機體免疫系統(tǒng)清除。為了進一步驗證藥物的開發(fā)潛力，本試驗對其安全性和在細胞體內(nèi)活性進行了考察，其中A549細胞活性試驗表明補骨脂二氫黃酮甲醚在抑制STX的有效質(zhì)量濃度內(nèi)使用安全。細胞黏附試驗證明補骨脂二氫黃酮甲醚能夠顯著降低USA300菌株黏附細胞的能力，有進一步體內(nèi)研究的價值。

S.aureusSTX是由三萜類胡蘿卜素經(jīng)一系列酶的反應(yīng)催化加工而成的C30鏈。通過RT-PCR在轉(zhuǎn)錄水平上對補骨脂二氫黃酮甲醚處理后樣品的STX生成相關(guān)基因進行檢測分析，STX上游途徑產(chǎn)物合成酶基因ispA，STX合成途徑中催化酶基因crtM、crtN、crtO、crtP、crtQ轉(zhuǎn)錄均受到抑制。推測這一結(jié)果產(chǎn)生的原因可能是由于補骨脂二氫黃酮甲醚作用于STX產(chǎn)生途徑的上游調(diào)控機制，如sigB因子等而發(fā)揮作用的[17]，這有待后續(xù)進一步研究。

病原菌引發(fā)感染是一個復(fù)雜的過程，需要多種毒力因子的協(xié)同作用[18]?？苟玖λ幬锟蛇x擇性地遏制目標菌的毒素表達、毒素傳遞、細菌黏附和細菌的免疫逃避等，從而降低細菌的致病性。這種抗菌策略阻止了由于生存壓力導(dǎo)致的細菌耐藥性。本研究篩選出的S.aureusSTX抑制劑補骨脂二氫黃酮甲醚為新的抗生素的替代藥物和輔助藥物的開發(fā)提供可靠的理論基礎(chǔ)和優(yōu)秀的先導(dǎo)化合物。