嚴冰璇，劉 睿，葉璐婕，譚 勛*

(1.浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058; 2.浙江大學 動物醫(yī)學中心，浙江 杭州 310058)

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一類在進化上高度保守的多功能細胞因子，具有調(diào)控細胞增殖、分化、遷移和細胞外基質(zhì)形成等多種生物學功能[8]。在哺乳動物中的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β參與調(diào)控血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的增殖和凋亡，在新生血管形成和血管穩(wěn)態(tài)維持機制中發(fā)揮重要作用[9-10]。TGF-β信號通路失調(diào)可導致動脈粥樣硬化、高血壓、血管纖維化等多種心血管疾病的發(fā)生[11-14]。TGF-β有TGF-β1、TGF-β2和 TGF-β3等3種亞型，其中TGF-β1在肺血管病理生理中的作用受到廣泛關注[15]。缺氧是誘導PAH肺血管重構的重要原因之一[16]。本試驗旨在探究TGF-β1對缺氧條件下 PASMCs增殖和遷移的調(diào)控作用，進一步揭示PAH肉雞肺血管重構的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試驗動物PAH肉雞和正常肉雞肺組織石蠟切片由本實驗保存[17]；原代雞胚成纖維細胞由本實驗室自行分離并-80℃保存；2～3周齡肉雞(品種：AA)、9周齡成年雌性BALB/c小鼠購自浙江大學動物實驗中心。

1.2 主要試劑2×Rapid Taq Master Mix、限制性內(nèi)切酶、HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；弗氏不完全佐劑、SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提試劑盒、SanPrep 柱式 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；二喹啉甲酸(bicinchonininc acid，BCA)蛋白定量測定試劑盒、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)購自大連美侖生物技術有限公司；一步法凝膠制備試劑盒購自杭州弗德生物科技有限公司；His60 Ni gravity columns 購自寶生物(大連)工程有限公司；MolPure Cell/Tissue Total RNA Kit 細胞/組織總 RNA 提取試劑盒購自翌圣生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司; 透析袋MD44(3500D)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 菌種和質(zhì)粒pET-28a(+)載體由本實驗室保存；DH5α和 BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.4 禽TGF-β1重組蛋白的表達及純化選擇 Gallus gallus TGF-β1(登錄號：NP_001305385.1)序列中的 280 aa～292 aa 肽段，設計引物擴增其編碼基因片段，分別在上、下游引物引入 EcoRⅠ 和 XhoⅠ 酶切位點。引物序列如下：上游引物P1 5′-CG-GAATTCCTCGACACCGACTACTGCTT-3′；下游引物P2 5′-CCCTCGAGGCT GCACTTGCAG-GCAC-3′。提取雞胚成纖維細胞 mRNA，利用 HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR 試劑反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，應用前述引物擴增目的片段。擴增產(chǎn)物用 SanPrep 柱式 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ 和 XhoⅠ消化后，連接至 pET-28a(+)載體并轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆測序(杭州擎科生物科技有限公司)，將測序正確的陽性克隆于 37℃ 條件下擴大培養(yǎng)，用 SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至 BL21(DE3)感受態(tài)，IPTG 誘導表達4 h。1 500×g離心10 min，收集菌體并重懸于含有 8 mol/L 尿素的磷酸鹽緩沖溶液中，超聲破碎，13 000×g離心40 min，收集上清，采用鎳離子柱純化目的蛋白，采用 SDS-PAGE 凝膠電泳對獲得的蛋白進行驗證。

1.5 禽TGF-β1重組蛋白(chTGF-β1)多克隆抗體制備將純化的 chTGF-β1重組蛋白與弗氏不完全佐劑以1∶1的劑量乳化30 min，按200 μg/只的劑量免疫BALB/c小鼠。于首免后3，4 周各加強免疫1次。最后1次免疫后 3 d摘除眼球采血，分離血清。采用免疫印跡法檢測抗體與雞胚成纖維細胞和肉雞肺組織中TGF-β1蛋白的結合能力。

1.6 免疫組化染色切片常規(guī)脫蠟進水，3% H2O2溶液處理15 min后，置于Tris-EDTA緩沖液pH9.0)中高壓修復3 min，流水沖洗10 min后，用10%新生血清封閉20 min。將TGF-β1抗體(1∶50稀釋)滴加在切片上，4℃ 孵育過夜。切片經(jīng)PBS 液漂洗后，置于羊抗鼠IgG二抗(1∶500稀釋)中，37℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。每張切片隨機挑取15～20個肺動脈(φ<200 μm)，采用Image J圖像分析軟件測量肺血管D值并計算平均值，以平均值作為每只肉雞的代表值。

1.7 PASMCs分離培養(yǎng)參照本實驗室建立的方法分離培養(yǎng)PASMCs[7]。選取2～3周齡肉雞，頸靜脈放血處死后迅速分離肺動脈，立即投入含有1%慶大霉素的PBS溶液中漂洗。將肺動脈浸入DMEM培養(yǎng)基中，縱向切開血管，用手術刀切割成約為0.2 cm×0.2 cm的小塊，均勻貼于6孔細胞培養(yǎng)板中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1.5 h，使其貼壁完全。加入含有0.5%慶大霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，39℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細胞長至融合后傳代，取2～3代細胞進行試驗。

當然，周圍許多同學都對他的行為表示不可理解。而他則認為風水是集美學、環(huán)境學、地理學、易經(jīng)等等為一體的學科，是流傳了幾千年的文化，可與自己的專業(yè)結合起來運用，在風水策劃的基礎上加入合理的園林設計。因此他遵循自己的興趣，毫不猶豫地報名學習了這門課程。

1.8 EPCs分離培養(yǎng)參照本實驗室建立的方法分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞(endothelia progenitor cells,EPCs)[18]。選取2～3周齡肉雞，翅靜脈采血，采用雞外周血單個核細胞分離液試劑盒于2 h內(nèi)分離得到雞外周血單個核細胞，用含有VEGF(0.100 ng/L)、FGF(0.002 ng/L)、IGF(0.002 ng/L)和10% 新生牛血清的雞內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)基重懸，按1×107/孔的量接種于6孔細胞培養(yǎng)板，39℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，48 h后去除非貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，Dil-ac-LDL、FITC-lectin雙染法鑒定細胞表型[18]。

1.9 肺動脈離體培養(yǎng)選取2～3周齡肉雞，撲殺后迅速分離肺動脈，立即投入含有1%慶大霉素的PBS溶液中漂洗后，切成約1 cm的節(jié)段，置于含有0.5%慶大霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于常氧(21%O2、5%CO2)和低氧(5%O2、5%CO2)下培養(yǎng)48 h。取出肺動脈節(jié)段，制作石蠟切片，切片厚度為5 μm。

1.10 免疫印跡蛋白樣品12%SDS-PAGE電泳后，恒流 300 mA 條件下轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，置于TGF-β1 抗體(1∶1 000稀釋)中4℃孵育過夜。TBST緩沖液漂洗3次，加入羊抗鼠 IgG(1∶3 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST緩沖液漂洗3次，ECL顯色。

1.11 CCK-8細胞增殖試驗將2～3代PASMCs按2×104/孔的量接種于96孔板中，血清饑餓24 h后，分別于常氧(21%O2)和低氧(5%O2)下培養(yǎng)，并向培養(yǎng)基中加入重組chTGF-β1(終質(zhì)量濃度為20 μg/L)，以不加chTGF-β1處理的細胞為對照。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，測D450 nm值。

1.12 細胞劃痕試驗將PASMCs按5×105/孔的量接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，至細胞完全融合時，用移液器頭進行劃痕，并加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基。將細胞置于常氧(21%O2、5%CO2)和低氧(5%O2、5%CO2)下培養(yǎng)，并向培養(yǎng)基中加入chTGF-β1(終質(zhì)量濃度為20 μg/L)，以不加chTGF-β1處理的細胞為對照。于0，12，24 h 時拍照，采用Image J圖像分析軟件測量劃痕間距長度。

2 結果

2.1 chTGF-β1表達、純化及多克隆抗體制備以雞胚成纖維細胞來源的 cDNA 為模板，擴增出1條長度在 300～400 bp 之間的條帶，與目的基因預期長度(339 bp)相符(圖1A)。將純化的目的片段插入 pET-28a(+)載體，轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細胞，挑取陽性菌落擴增目的條帶，擴增出的條帶大小與預期相符(圖1B)。質(zhì)粒測序結果顯示，TGF-β1基因成功克隆入 pET-28a(+)載體。提取pET-TGF-β1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染BL21 感受態(tài)細胞，IPTG誘導表達4 h，表達產(chǎn)物采用鎳柱進行純化。SDS-PAGE 凝膠電泳顯示，純化獲得的蛋白相對分子質(zhì)量約為12.92 kDa(圖1C)，與目的蛋白預期大小相符，表明 chTGF-β1 成功表達。將純化獲得的chTGF-β1置透析袋中透析除鹽，免疫小鼠后獲得鼠抗禽多克隆TGF-β1抗體。提取雞胚成纖維細胞與肉雞肺組織總蛋白，利用制備的抗血清，采用免疫印跡法檢測TGF-β1表達，結果顯示制備的TGF-β1多克隆抗體可檢測到TGF-β1蛋白(圖1D)。

A.目的基因TGF-β1的PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳(M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.組織樣本；2.陰性對照)；B.陽性克隆菌液PCR 擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳(M.DNA相對分子質(zhì)量標準; 1.陽性克??；2.陰性對照)；C.chTGF-β1重組蛋白純化(M.蛋白相對分子質(zhì)量標準；1.鎳柱親和層析純化獲得的蛋白；2.全菌蛋白)；D.免疫印跡法驗證TGF-β1抗體對TGF-β1蛋白的識別(M.蛋白相對分子質(zhì)量標記物；1.雞胚成纖維細胞總蛋白;2.肉雞肺組織總蛋白)

2.2 PAH肉雞肺血管TGF-β1表達變化以本試驗制備的鼠抗禽TGF-β1抗體為一抗，商品化羊抗鼠IgG作為二抗，對正常肉雞和PAH肉雞肺組織切片進行免疫組化染色。結果顯示，TGF-β1在肺組織中廣泛分布。在對照肉雞的肺小動脈中，TGF-β1主要分布于血管內(nèi)膜和外膜，在血管中膜僅有微弱表達(圖2A)；在PAH肉雞肺小動脈中，TGF-β1在內(nèi)膜、中膜和外膜上均有表達(圖2B)。采用Image J圖像分析軟件測量肺小動脈(φ<200 μm)整體和中膜D值，結果顯示PAH肉雞肺小動脈整體(圖2C)和中膜中(圖2D)TGF-β1表達水平均顯著高于正常肉雞。

A.對照肉雞肺組織；A1.圖A局部放大；B.PAH肉雞肺組織；B1.圖B局部放大；C.肺動脈總體光密度值(n=36)；D.肺動脈中膜光密度值(n=9)

2.3 TGF-β1促進缺氧誘導的平滑肌細胞增殖分別于常氧(21%O2)和缺氧(5%O2)條件下，用chTGF-β1(終質(zhì)量濃度為20 μg/L)處理PAMSCs 24 h，采用CCK8試劑盒檢測細胞增殖。結果顯示，缺氧可顯著促進PAMSCs增殖，chTGF-β1處理可顯著促進缺氧誘導的細胞增殖(圖3)。

圖3 TGF-β1對PASMCs增殖的影響(n=7)

2.4 TGF-β1促進缺氧誘導的平滑肌細胞遷移待PASMCs生長至完全融合后，用移液器頭進行劃痕處理，隨后分別于常氧(21%O2)和低氧(5%O2)下培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中加入chTGF-β1，于不同時間點觀察并測量劃痕間距長度以反映細胞遷移能力。結果顯示，單獨缺氧和TGF-β1處理均能顯著促進PASMCs遷移，且TGF-β1可促進缺氧誘導的肺血管平滑肌細胞遷移，這一效應在處理早期(12 h之內(nèi))最為明顯(圖4,5)。

圖4 代表性圖片顯示缺氧和TGF-β1處理對PAMSCs遷移的影響

圖5 劃痕間距定量分析(n=4)

2.5 缺氧和TGF-β1刺激對PASMCs和EPCs表達TGF-β1的影響為明確PAH發(fā)生過程中TGF-β1通過旁分泌或自分泌途徑作用于PASMCs，分別構建PASMCs和EPCs(模擬內(nèi)皮細胞)缺氧細胞模型，并在培養(yǎng)基中添加chTGF-β1(終質(zhì)量濃度為20 μg/L)，處理48 h后，檢測內(nèi)源性TGF-β1的表達變化。結果顯示，單獨缺氧或缺氧與外源性chTGF-β1聯(lián)合處理對PASMCs中內(nèi)源性TGF-β1表達均無顯著性影響；相反，缺氧可顯著促進EPCs表達TGF-β1，外源性TGF-β1刺激有升高缺氧狀態(tài)下EPCs表達TGF-β1的趨勢，但與單獨缺氧組相比差異不顯著(圖6)。結果表明，缺氧過程中TGF-β1可通過旁分泌的方式作用于PASMCs。

A.缺氧不影響PASMCs表達TGF-β1(n=3)；B.缺氧促進EPCs表達TGF-β1(n=5)

2.6 缺氧對肺小動脈中膜表達TGF-β受體的影響為進一步明確缺氧過程中TGF-β1通過旁分泌方式作用于肺小動脈PASMCs，構建了離體肺動脈低氧模型并采用免疫組化法檢測TGF-β受體1(TGFβR-1)的表達變化。如圖7所示，缺氧處理48 h 后肺動脈中膜中TGFβR-1表達陽性明顯增強。采用Image J圖像分析軟件測量中膜的D值，結果顯示缺氧組肺動脈中膜中TGF-βR1表達水平顯著高于常氧組(圖8)。

圖7 免疫組化法檢測常氧與缺氧條件下離體肺動脈中膜TGFβR-1表達的代表性圖片

圖8 常氧與缺氧條件下離體肺動脈中膜TGFβR1表達的半定量分析(n=5)

3 討論

肺血管重構是PAH肉雞的重要組織病理學特征，是導致肺動脈壓升高的重要原因[19-21]。目前認為，PAH肺血管重構不僅涉及PASMCs增殖，也涉及PASMCs向遠端血管遷移，后者可導致非肌型肺小動脈肌型化，造成肺小動脈進行性閉塞和肺循環(huán)阻力持續(xù)升高，促進PAH發(fā)生[22-24]。PAH肺血管重構的發(fā)生機制尚不完全清楚，早期的研究發(fā)現(xiàn)，PAH肉雞肺血管中血小板衍生生長因子(PDGF)[25]、內(nèi)皮素-1(ET-1)[26]等表達升高。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP2)表達升高[7]和一氧化氮(NO)生成不足[26-27]也與PAH肉雞肺血管重構的病理過程有關，這些研究提示PAH肉雞肺血管重構可能是多種因素共同作用的結果，其機制仍需進一步探明。

PAH也是人類的一種高度致死性疾病。越來越多的研究表明，TGF-β信號通路障礙在人PAH發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[28-31]，被認為是治療PAH的靶點[32]。本試驗結果表明，TGF-β1在正常肉雞肺血管中膜中僅有微弱表達，在PAH肉雞肺血管中膜中表達升高，與PAH病人中TGF-β1的變化相一致[33]，提示TGF-β1表達升高與PAH肉雞肺血管重構有關。為進一步證實這一猜測，本試驗利用低氧(5%O2)暴露細胞模型，觀察了低氧和TGF-β1對PASMCs增殖和遷移的影響，結果發(fā)現(xiàn)低氧可顯著促進PASMCs增殖及遷移，TGF-β1可進一步促進低氧誘導的細胞增殖及遷移。上述結果提示，TGF-β1在PAH肉雞肺血管重構過程中發(fā)揮重要作用。

血管主要由內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞2類細胞構成，這2類細胞相互作用，維持血管功能和穩(wěn)態(tài)[34]。肺動脈內(nèi)皮細胞可產(chǎn)生多種旁分泌細胞因子(如5-羥色胺、ET-1)，促進PASMCs增殖和肺血管重構[35]。EPCs是一類可定向分化為內(nèi)皮細胞的細胞，既具有祖細胞的特征，又具有內(nèi)皮細胞的特征。我們前期的研究表明，EPCs功能障礙與PHA肉雞血管病變有關[36]。本試驗利用EPCs構建內(nèi)皮細胞低氧處理模型，比較了低氧對EPCs和PASMCs表達TGF-β1的影響，結果發(fā)現(xiàn)低氧處理可促進EPCs表達TGF-β1，而對PASMCs表達TGF-β1無顯著性影響。這一結果提示，在PAH發(fā)生過程中，內(nèi)皮細胞分泌的TGF-β1可能通過旁分泌的方式作用于PASMCs，引起PASMCs增殖和遷移，從而促進血管重構。由于缺氧刺激并不促進PASMCs表達TGF-β1，所以本試驗中免疫組化染色觀察到的PAH肉雞肺血管中膜TGF-β1升高可能是內(nèi)皮細胞分泌的TGF-β1彌散入中膜的結果。

TGF-β家族成員通過與受體 TGFβR-2和TGFβR-1形成復合物而發(fā)揮生物學效應。TGF-β 首先與 TGFβR-2的胞外結構域結合，進而募集TGFβR-1，使TGFβR-1發(fā)生磷酸化而激活[37]。利用PAH疾病模型的研究發(fā)現(xiàn)，阻斷TGFβR-1活性可顯著抑制PASMCs增殖，并改善血液動力學和肺血管重構[38-39]。本試驗模擬PAH肉雞體內(nèi)缺氧環(huán)境，構建了離體肺動脈低氧處理模型，觀察了缺氧對肺血管中膜TGFβR-1表達的影響，發(fā)現(xiàn)缺氧可促進肺血管中膜TGFβR-1表達上調(diào)。這一結果進一步提示，在PAH發(fā)生過程中，TGF-β1可能通過旁分泌方式促進肺動脈中膜重構。進一步工作可觀察阻斷TGF-β1信號對PAH肉雞肺血管重構的影響。

本試驗結果表明，在PAH發(fā)病過程中，TGF-β1可能通過旁分泌機制作用于PASMCs，誘導PASMCs增殖和遷移，進而促進肺血管重構。干預TGF-β1信號通通路可能有助于防制肉雞PAH。