尹云厚，張軍芳，郭盼盼，唐 琳，李香子，嚴(yán)昌國，金 鑫

(1.貴州民族大學(xué)，貴陽 貴州 550025；2.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；3.延邊大學(xué) 實驗動物中心，吉林 延吉 133002)

肉牛脂肪酸組成對肌內(nèi)脂肪沉積具有重要影響。油酸是肉牛肌內(nèi)脂肪組織中含量最豐富、最重要的單不飽和脂肪酸，是發(fā)達(dá)國家牛肉品質(zhì)評定體系中最為重要的評價指標(biāo)之一。研究表明，油酸作為γ-過氧化物酶體激活物受體(peroxisome proliferators-activated receptor-γ,PPARγ)的天然配體，能夠激活PPARγ與視黃醇類X受體形成異源二聚體，調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抗氧化方面有別于其他類型的脂肪酸[1-2]。同時，油酸也是PPARγ的內(nèi)源性活化劑，可以誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞中甘油三酯的積累[3]，通過調(diào)控PPARγ來影響脂肪生成和基因下游產(chǎn)物的表達(dá)，可作為誘導(dǎo)促進(jìn)劑調(diào)控前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化[4]。在延邊牛肌內(nèi)脂肪中，油酸含量越高，肌內(nèi)脂肪含量也越高。但是，油酸如何調(diào)控延邊牛脂肪細(xì)胞分化并參與脂肪沉積的相關(guān)機制目前尚不清楚。因此，本試驗利用油酸誘導(dǎo)延邊牛前體脂肪細(xì)胞分化，通過分析油酸對細(xì)胞內(nèi)脂滴形成、甘油三酯生成及成脂相關(guān)基因的表達(dá)，研究油酸在脂肪細(xì)胞分化過程中的影響；旨在闡明油酸對延邊牛前體脂肪細(xì)胞分化的影響及其對成脂相關(guān)基因的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞試驗所用的延邊牛前體脂肪細(xì)胞由延邊大學(xué)東北寒區(qū)肉牛科技創(chuàng)新教育部工程研究中心鑒定并保存。

1.2 主要試劑澳洲胎牛血清FBS、DMEM高糖培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶EDTA-triypsin、無鈣鎂磷酸鹽緩沖液、鏈霉蛋白酶、4%多聚甲醛購自Gibco公司；青鏈霉素混合液、油紅O染色試劑盒(G1262)購自Solarbio公司；甘油三酯測定試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；熒光定量試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；50×電泳液購自沈陽匯佰生物科技有限公司；CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 牛前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化待傳代至第3代的前體脂肪細(xì)胞完全匯合后分別進(jìn)行分化處理，利用分化液(5%FBS/DMEM+油酸100 μmol/L)進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換1次分化液，分別收集處理0，24，48，72，96，120 h的前體脂肪細(xì)胞用于下一步試驗，以0 h為對照組。

1.4 生長曲線的繪制待前體脂肪細(xì)胞的匯合度達(dá)到70%～80%時，用PBS緩沖液輕輕地沖洗3次后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，使細(xì)胞與胰蛋白酶消化液充分接觸后，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 min，取出后，將細(xì)胞按一定比例傳至96孔板中，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將20 μL的Cell Titer 96Aqueous One Solution(事先已于室溫中靜置60～90 min)加入到96孔板的每個小孔中，小心混勻，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)箱中孵育3 h，孵育結(jié)束后設(shè)置好調(diào)零孔，用酶標(biāo)儀檢測各孔D490 nm值，每次取3孔細(xì)胞，每隔24 h測定1次，進(jìn)行MTS測定。

1.5 油紅O染色參考油紅O染色試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 RNA的提取及熒光定量PCRTRIzol法提取脂肪細(xì)胞mRNA后進(jìn)行cDNA合成。利用預(yù)先設(shè)計好的引物(表1)，以GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR，具體反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行。

表1 PCR引物序列

1.7 數(shù)據(jù)分析用Graphpad Prism 6.07統(tǒng)計學(xué)軟件對基因的相對表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析和多重比較分析并繪制柱形圖(P<0.05表示差異顯著)。

2 結(jié)果

2.1 延邊牛前體脂肪細(xì)胞的鑒定利用前體脂肪細(xì)胞因子基因Pref-1對所分離出的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1所示，分化后Pref-1的表達(dá)不斷降低，至分化第6天時，幾乎不表達(dá)，因此驗證所分的細(xì)胞為延邊牛前體脂肪細(xì)胞。

圖1 延邊牛前體脂肪細(xì)胞的鑒定

2.2 油酸對延邊牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中形態(tài)變化的影響分化處理開始后，每隔24 h觀察1次細(xì)胞(圖2)?？梢钥闯?，分化處理24 h后，形態(tài)發(fā)生明顯變化，未染色條件下便可觀察到細(xì)胞核周圍類似脂滴物質(zhì)出現(xiàn)；分化72 h時，細(xì)胞形態(tài)變化更加明顯，肉眼可見明顯脂滴，說明經(jīng)油酸處理后的前體脂肪細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長細(xì)胞形態(tài)不斷發(fā)生變化。

2.3 油酸對延邊牛前體脂肪細(xì)胞脂滴形成的影響對不同分化時間的細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，結(jié)果如圖3所示。分化24 h時便可觀察到細(xì)胞核周圍有被染成紅色的圓形脂滴出現(xiàn),隨著處理時間的延長，脂滴數(shù)量不斷增多，大小也不斷增大，待120 h時，脂滴密度和大小也變得更大，細(xì)胞邊界也已變得不再清晰。

圖3 不同分化時間油紅O染色效果(×200)

2.4 油酸對延邊牛前體脂肪細(xì)胞的甘油三酯濃度的影響油酸處理后24 h開始，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的濃度逐漸升高，各處理組均高于對照組(圖4)，其中，96 h處理組的甘油三酯濃度最高，極顯著高于0，24，48 h組(P<0.05)，120 h開始略下降，但與96 h 處理組無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 油酸處理后不同時間的甘油三酯濃度變化

2.5 油酸對延邊牛前體脂肪細(xì)胞成脂相關(guān)基因表達(dá)的影響由圖5可以看出，經(jīng)油酸處理后,各成脂相關(guān)基因的表達(dá)隨分化時間不同，各自呈現(xiàn)不同變化趨勢，PPARγ基因的相對表達(dá)量在誘導(dǎo)開始后顯著上升，至48 h時達(dá)到最高值(P<0.05)，隨后緩慢下降，至96，120 h時已顯著低于48 h，但仍顯著高于0 h(P<0.05)；C/EBPα、FABP4和PLIN2基因的相對表達(dá)量經(jīng)油酸處理后先逐漸升高，到96 h 時達(dá)到最高(P<0.05)，之后開始略下降，但仍顯著高于對照組(P<0.05)；LPL基因在誘導(dǎo)開始后先顯著下降而后恢復(fù)到處理前的水平；C/PT1β和SREBP1基因的相對表達(dá)量在油酸處理后不斷升高，到120 h時達(dá)到最高(P>0.05)；SCD基因在處理24 h開始顯著下降(P>0.05)，在120 h時達(dá)到最低(P<0.05)。結(jié)果表明，在延邊牛前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中加入油酸，對主要成脂相關(guān)基因的相對表達(dá)量起著不同的調(diào)節(jié)作用，且隨著處理時間的不同，各基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。

圖5 不同處理時間成脂相關(guān)基因的表達(dá)量變化

2.6 油酸對延邊牛前體脂肪細(xì)胞成脂相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響對誘導(dǎo)48，96 h的脂肪細(xì)胞中成脂標(biāo)志基因PPARγ和C/EBPα的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，如圖6所示，PPARγ基因經(jīng)油酸處理后，48 h時表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，在96 h時顯著下降，但仍顯著高于0 h組，表現(xiàn)出誘導(dǎo)后先升后降維持高水平表達(dá)的趨勢，而C/EBPα基因在經(jīng)油酸處理后，蛋白表達(dá)量不斷升高，96 h時表達(dá)量最高(P<0.05)。Western blot檢測條帶與mRNA表達(dá)規(guī)律不完全一致，說明可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的機制。

圖6 成脂關(guān)鍵因子的蛋白表達(dá)規(guī)律

3 討論

脂肪酸可分為飽和脂肪酸(saturated fatty acids,SFAs)和不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids,UFAs)。脂肪酸能夠通過調(diào)節(jié)PPARs、肝細(xì)胞核因子-4a、肝臟X受體和SREBPs等多種轉(zhuǎn)錄因子和核受體參與調(diào)節(jié)脂肪的生成、代謝效率、胰島素作用、物質(zhì)合成和機體組成等多種生物學(xué)功能。有研究表明,脂肪酸可參與脂肪細(xì)胞的生理功能的調(diào)控和脂肪代謝[4-6]。作為PPARγ的天然激動劑，油酸可作為脂肪細(xì)胞分化的誘導(dǎo)促進(jìn)劑[7]。油酸能調(diào)節(jié)PPARγ、LPL及C/EBPα的表達(dá)，促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞的分化，而且其促細(xì)胞分化的能力比12碳、16碳和18碳飽和脂肪酸強[4]。

油酸在人體還發(fā)揮著保護心血管、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、改善氧化應(yīng)激等多種重要功能[8-11]。研究表明，OA是牛肌肉和脂肪組織中含量最豐富的脂肪酸[12-14]，脂肪組織質(zhì)量的增加伴隨著OA的相應(yīng)增加[15-16]。日本黑牛的肌肉OA異常高[12,17],其獨特之處在于其在肌筋膜中含有脂肪細(xì)胞[18-19]。

大多數(shù)關(guān)于脂肪細(xì)胞分化的研究采用多種誘導(dǎo)物聯(lián)合對前體脂肪細(xì)胞共同作用，也有研究者探索了前體脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞在單一添加物添加作用下的成脂分化，通過檢測脂肪組織分化(C/EBPβ，PPARγ)和脂質(zhì)代謝(AMPKα，CPT1β，GPR43，SCD)的標(biāo)志基因來研究脂肪酸對成脂分化的影響[20-23]。有研究表明，PPARγ的表達(dá)受到C/EBPβ的強烈促進(jìn)，從而啟動前體脂肪細(xì)胞的分化[24-25]，另外抑制SCD催化活性可降低與脂肪酸合成相關(guān)的基因(如脂肪酸合成酶)的活性，同時增加了與脂肪酸氧化相關(guān)的基因(如CPT1β)的表達(dá)[26-27]。本試驗以100 μmol/L的油酸作為誘導(dǎo)分化劑,研究不同處理時間(0,24,48,72,96,120 h)油酸對延邊牛脂肪細(xì)胞分化過程中的脂滴形成、甘油三酯濃度及成脂相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明通過油紅O染色，24 h時便可觀察到脂滴形成，且隨著處理時間的增加，脂滴不斷增多、增大，甘油三酯含量也增加；成脂相關(guān)基因的相對表達(dá)量隨處理時間的不同各自呈現(xiàn)出不同的變化，如PLIN2基因在經(jīng)油酸處理后表達(dá)量顯著升高。油酸處理后SCD基因的表達(dá)顯著降低，該結(jié)論與已報道的研究結(jié)果一致[23]，說明單一添加物油酸即可有效誘導(dǎo)延邊牛前體脂肪細(xì)胞成脂分化。該誘導(dǎo)方法簡單易行，可為后續(xù)高通量篩選候選功能基因提供試驗材料。

本試驗結(jié)果表明，油酸可誘導(dǎo)延邊牛前體脂肪細(xì)胞分化、促進(jìn)脂滴形成及提高甘油三酯濃度，同時可調(diào)控成脂相關(guān)基因(PPARγ、C/EBPα、LPL、FABP4、SCD、CPT1β、SREBP1和PLIN2)及蛋白(PPARγ、C/EBPα)的表達(dá)。