朱晉佳，吳祎程，呂小康，周傳社

(中國(guó)科學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

近年來(lái)，為了提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能和動(dòng)物生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)反芻動(dòng)物進(jìn)行了高谷物飼糧的飼喂[1]。適宜的精粗比能夠提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，最終提高生產(chǎn)性能。改變飼糧精粗比其本質(zhì)上是改變了飼糧的非纖維碳水化合物(NFC)/中性洗滌纖維(NDF)比例。NFC主要包括淀粉、糖、果膠、果聚糖和有機(jī)酸等，是反芻動(dòng)物的主要能量物質(zhì)；NDF是粗飼料的主要組成成分[2]。因此飼糧結(jié)構(gòu)的變化是反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段[3]。據(jù)報(bào)道，提高飼糧NFC/NDF比例能夠提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能，這也是生產(chǎn)中通常采用的做法。犢牛在飼喂NFC/NDF為1.35的全混合飼糧時(shí)，相比于飼喂NFC/NDF為0.80的飼糧不僅可以提高犢牛生長(zhǎng)性能[4]，還可以使肉犢牛保持較高的平均日增重[5]。朱昊鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)，提高荷斯坦奶牛飼糧中NFC/NDF的比值，可以顯著提高奶牛的生長(zhǎng)性能。董利鋒等[7]研究也進(jìn)一步證實(shí)了飼糧中高NFC/NDF可以顯著提高反芻動(dòng)物干物質(zhì)消化率、日增重等生長(zhǎng)性能。生長(zhǎng)性能的提高與肌肉的生長(zhǎng)密切相關(guān)，肌肉中蛋白質(zhì)和能量代謝是影響肌肉生長(zhǎng)的主要原因[8]。但是，NFC/NDF比例對(duì)肉牛肌肉蛋白質(zhì)和氨基酸代謝的潛在機(jī)制仍然未知，需要進(jìn)一步探究。肉用動(dòng)物的肉品質(zhì)是決定養(yǎng)殖利潤(rùn)的關(guān)鍵所在，氨基酸作為主要的風(fēng)味物質(zhì)決定了肉的風(fēng)味，飼糧是影響肉質(zhì)的一個(gè)重要因素，改變飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量或者組成的變化，皆可引起肉品質(zhì)風(fēng)味的變化[9]。因此，本試驗(yàn)選擇生長(zhǎng)期肉牛作為試驗(yàn)動(dòng)物，探究不同NFC/NDF比例飼糧對(duì)肉牛肌肉氨基酸和蛋白質(zhì)代謝的影響。本研究獲得了動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有涉及的動(dòng)物程序都按照中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所機(jī)構(gòu)的動(dòng)物保護(hù)指南進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用單因素完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)。28頭體質(zhì)健康、體質(zhì)量(255±16.3)kg的安本雜牛×湘西黃牛隨機(jī)分為2個(gè)處理組，每組14頭。其中，對(duì)照組飼喂NFC/NDF為1.11的低精料全混合飼糧(total mixed ration,TMR)，試驗(yàn)組飼喂NFC/NDF為4.05的高精料全混合飼糧(TMR)。試驗(yàn)總周期為100 d，其中預(yù)飼期15 d，正試期85 d。100 d后進(jìn)行屠宰，屠宰前24 h禁食。

1.2 飼糧和動(dòng)物管理試驗(yàn)肉牛飼糧按照肉牛營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制(NRC,2000)。肉牛飼糧為全混合飼糧，肉牛試驗(yàn)飼糧組成成分及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。整個(gè)試驗(yàn)期間每天飼喂2次，分別在每日上午7：00和下午17：00喂食，全天自由飲水，定期打掃畜舍和清潔水槽，按照正常的免疫程序?qū)υ囼?yàn)牛進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)、免疫。

表1 飼糧原料成分及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ)) %

1.3 樣品采集與處理正式試驗(yàn)結(jié)束后，肉牛禁食24 h，禁水12 h后屠宰。屠宰后立即分離背最長(zhǎng)肌，用PBS沖洗干凈，用剪刀剪成1 cm×1 cm小塊，裝在采樣袋中，置于-80℃液氮中保存，用于后續(xù)樣品分析。

1.4 樣品分析

1.4.1背最長(zhǎng)肌RNA的提取及cDNA的合成 使用RNAiso Plus(TaKaRa，大連，9108/9109)從背最長(zhǎng)肌中提取總RNA，使用DNaseⅠ(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)去除基因組DNA。提取后使用NanoDrop 2000(Thermo Scientific,Waltham,USA)測(cè)定肌肉中總RNA純度和濃度。使用Evo M-MLV RT試劑盒(AG11706，中國(guó)長(zhǎng)沙)，在20 μL的體系中將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,最后將cDNA存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2目的基因mRNA表達(dá)量的測(cè)定 利用SYBR Premix Ex TaqⅡ TaKaRa，大連，中國(guó))在ABI-7900HT qPCR系統(tǒng)(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司,美國(guó)福斯特城)上進(jìn)行qPCR測(cè)定，選擇β-actin作為內(nèi)參基因。所有引物均由上海生工合成(Sangon Biotech,中國(guó)上海)。目的基因引物序列及參數(shù)信息見(jiàn)表2。根據(jù)2-△△Ct方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表2 引物序列及參數(shù)信息

1.4.3背最長(zhǎng)肌氨基酸含量測(cè)定 將肌肉樣品冷凍干燥，稱(chēng)取干燥過(guò)的肉樣0.8 g，放入離心管中，用鹽酸勻漿，超聲浸提30 min，搖勻后過(guò)濾。取2 mL過(guò)濾后的濾液于離心管中，加入2 mL 8%磺基水楊酸混勻，靜置15 min，轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min。取下層液體，孔徑0.22 μm濾膜過(guò)濾后，采用日立L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定肌肉中氨基酸的含量。

1.4.4Western blot技術(shù)檢測(cè)背最長(zhǎng)肌蛋白表達(dá)量 液氮凍存牛肌肉樣本解凍，轉(zhuǎn)至2 mL EP管中，加入RIPA裂解液，置于冰上裂解10 min，收集裂解液，4℃、12 000 r/min離心10 min；取上清液用BCA蛋白定量試劑盒(KGP903，南京凱基生物公司)測(cè)定蛋白濃度。

(1)取待測(cè)蛋白樣品(肌肉組織裂解液)2 μL用去離子水補(bǔ)足20 μL，加入200 μL BCA工作液，混勻后37℃放置30 min，然后以0號(hào)孔為對(duì)照，測(cè)定樣品562 nm波長(zhǎng)處的D值；根據(jù)所測(cè)樣品的D值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得樣品的蛋白含量(μg)。計(jì)算蛋白質(zhì)量濃度：以標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的相應(yīng)蛋白含量(μg)除以樣品稀釋總體積體積(20 μL)，乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測(cè)樣品的實(shí)際質(zhì)量濃度(g/L)。

(2)蛋白變性。各試驗(yàn)組取50 μL，按4∶1比例加入5×Loding buffer，混勻后熱循環(huán)儀95℃15 min，-80℃保存。

(3)電泳。往燒杯中依次加入去離子水、30%丙烯酰胺(Acrylamide)、1.5 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)(PH 8.8)、10%十二烷基磺酸鈉(SDS)充分混勻，再加入10%過(guò)硫酸銨(AP)和濃縮膠(TEMED)后立即搖勻，并用1 mL的移液槍加入到兩層玻璃板之間，然后在膠上加一層去離子水液封，37℃放置30 min，再按上述方法配制5%的積層膠，室溫放置30～60 min；待到積層膠凝固后將其拔出。將其放入電泳槽中根據(jù)所測(cè)蛋白濃度上樣。接通電源，穩(wěn)定電壓100 V，15 min，當(dāng)溴酚蘭染料到分離膠以后將電壓調(diào)至180 V繼續(xù)電泳，到達(dá)凝膠底部時(shí)終止電泳。

(4)轉(zhuǎn)膜。按照分離膠的尺寸剪1張PVDF膜(美國(guó)Hybond公司)和6張濾紙，將膜與切好的帶有目的條帶的分離膠一起放入轉(zhuǎn)膜液中平衡10 min，同時(shí)準(zhǔn)備兩塊海綿；用轉(zhuǎn)膜液將6張濾紙浸濕，按照海綿、濾紙(3張)、膜、凝膠、濾紙(3張)、海綿的順序疊放好；將凝膠面與負(fù)極相連，PVDF膜與正極相連，接通電源，200 mA轉(zhuǎn)膜1～2 h。

(5)封閉。將PVDF膜放入用TBST Buffer稀釋的5% BS搖2 h；用TBST將PVDF膜洗3次，每次5 min。

(6)孵育抗體。一抗孵育：將PVDF膜放入一抗中(一抗?jié)舛龋篟P36KB1 1∶500，P-RP36KB1 1∶250；FOXO3A 1∶500，P-FOXO3A 1∶500，elF4EBP1 1∶500，P-elF4EBP1 1∶250，mTOR 1∶1 000，P-mTOR 1∶1 000，β-actin 1∶10 000)，搖床上輕搖，4℃孵育過(guò)夜；用TBST將PVDF膜洗3次，每次5 min；二抗孵育：將PVDF膜放入二抗(稀釋濃度：1∶5 000)中，搖床上輕搖，室溫孵育2～3 h；用TBST將PVDF膜洗3次，每次10 min。

(7)顯影。將PVDF膜平鋪到保鮮膜上，將ECL發(fā)光液(BL520A，美國(guó)Thermo公司)的A、B兩種試劑等體積混合后，均勻的滴加到膜上，反應(yīng)1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀的暗室中，根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，曝光。

1.5 數(shù)據(jù)處理Western blot條帶先采用Gel-Pro Analyzer 4 分析灰度值，然后所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019進(jìn)行初步整理，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan法進(jìn)行多重比較，設(shè)置統(tǒng)計(jì)差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同NFC/NDF飼糧對(duì)肉牛肌肉氨基酸組成的影響由表3可知，從肉牛肌肉中共檢測(cè)出17種氨基酸。天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸在HCD組中的含量均顯著高于LCD組(P<0.05)。HCD組中總氨基酸的含量比LCD組高出15.38%(P<0.05)。其余5種氨基酸2組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 不同NFC/NDF飼糧對(duì)肉牛肌肉氨基酸組成的影響

2.2 不同NFC/NDF飼糧對(duì)肌肉蛋白質(zhì)合成基因mRNA表達(dá)量以及蛋白表達(dá)水平的影響由表4可知，與LCD組相比，HCD組肉牛肌肉IGF-1、S6K1、BCKDHA、BCAT、FOXO1和SLC38A2 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。與LCD組相比，HCD組肉牛肌肉FOXO3 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)。由圖1可知，HCD組p-mTOR、p-4EBP1、p-FOXO3A和S6K1蛋白表達(dá)量顯著高于LCD組(P<0.01)，2組間mTOR、4EBP1和p-S6K1的蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但HCD組FOXO3A蛋白表達(dá)量顯著低于LCD組(P<0.01)。

表4 不同NFC/NDF飼糧對(duì)肉牛肌肉蛋白質(zhì)合成基因mRNA表達(dá)量的影響

圖1 不同NFC/NDF飼糧對(duì)蛋白和磷酸化蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

3.1 不同NFC/NDF飼糧對(duì)肉牛肌肉氨基酸組成的影響動(dòng)物對(duì)飼糧中蛋白質(zhì)的吸收利用本質(zhì)上是對(duì)氨基酸的吸收利用，通過(guò)飼糧攝取的氨基酸的種類(lèi)和含量決定著蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而飼糧提供的各種氨基酸的平衡性影響著蛋白質(zhì)的吸收利用，飼糧結(jié)構(gòu)和動(dòng)物的品種影響肌肉中氨基酸的種類(lèi)和含量[17]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高精料(HCD)組中的氨基酸含量普遍高于低精料(LCD)組。谷氨酸和天冬氨酸可與還原糖相結(jié)合發(fā)生一定的化學(xué)反應(yīng)從而產(chǎn)生香味[18]。另?yè)?jù)報(bào)道，天冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸等幾種鮮味氨基酸的含量跟飼糧中精粗比的含量呈顯著的正相關(guān)[19]，這與我們的研究結(jié)果中HCD組天冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸顯著高于LCD組相一致。而甜味氨基酸中蘇氨酸、絲氨酸、賴(lài)氨酸在HCD組中均高于LCD組；芳香族類(lèi)氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸在HCD組中也高于LCD組，鮮味氨基酸、甜味氨基酸和芳香類(lèi)氨基酸這3大類(lèi)氨基酸與牛肉風(fēng)味有關(guān)，也是決定肉品質(zhì)的重要因子[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鮮味氨基酸、甜味氨基酸、芳香族類(lèi)氨基酸以及總氨基酸含量HCD組均高于LCD組，并且在以上氨基酸中,對(duì)肉的風(fēng)味影響最大的是谷氨酸,含量的高低與肌肉品質(zhì)呈顯著的正相關(guān)，而谷氨酸也在HCD組含量最高，這也說(shuō)明HCD組飼糧相比于LCD組，提高了牛肉的品質(zhì)，改善了牛肉風(fēng)味。氨基酸不僅在肉品質(zhì)方面發(fā)揮重要作用，對(duì)機(jī)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育也發(fā)揮這不可替代的功能。氨基酸可以作為機(jī)體代謝過(guò)程中的中間體或者信號(hào)分子，協(xié)調(diào)參與機(jī)體多種重要的生理過(guò)程[21]。支鏈氨基酸是動(dòng)物體中不能合成必須從飼料中獲得的氨基酸，包括：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，大量的研究表明支鏈氨基酸有多種生物學(xué)功能，最重要的功能是調(diào)控機(jī)體肌肉中蛋白質(zhì)合成[22]。亮氨酸以及代謝產(chǎn)物通過(guò)激活mTOR/S6K1信號(hào)通路，促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)合成[23]。支鏈氨基酸可以通過(guò)刺激mTOR靶點(diǎn)，與活性蛋白互作，促進(jìn)mRNA翻譯來(lái)刺激肌蛋白合成和沉積，提高機(jī)體蛋白質(zhì)的利用效率，減少氮沉積[24]。研究表明，在低蛋白飼糧中添加支鏈氨基酸，可以提高肌肉中氨基酸的含量，氨基酸通過(guò)增加肌肉蛋白合成、抑制蛋白質(zhì)降解，促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)，提高生產(chǎn)性能[25]。由此可見(jiàn)，飼糧中高NFC/NDF的比值，不僅提高了肉牛肌肉中單個(gè)有重要功能氨基酸的含量，還提高了總氨基酸含量，這也說(shuō)明無(wú)論是肌肉的風(fēng)味還是機(jī)體的生產(chǎn)性能都得到了極顯著的正反饋，利于肉牛的生長(zhǎng)。

3.2 不同NFC/NDF飼糧對(duì)肌肉蛋白質(zhì)合成基因mRNA表達(dá)量以及蛋白表達(dá)水平的影響本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中不同NFC/NDF比例影響反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)基因的表達(dá)，HCD組IGF-1的mRNA表達(dá)量顯著高于LCD組。IGF-1刺激牛骨骼肌中蛋白質(zhì)的合成，可以提高肌肉中蛋白質(zhì)的合成效率[26]。由于HCD組肌肉中支鏈氨基酸含量顯著提高，因此本試驗(yàn)測(cè)定了和支鏈氨基酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示HCD組與支鏈氨基酸代謝相關(guān)基因BCKDHA、BCAT和SLC38A2基因表達(dá)水平顯著高于LCD組，與HCD組肌肉中支鏈氨基酸含量顯著高于LCD組相一致。支鏈氨基酸(BCAA)亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、纈氨酸(Val)，已經(jīng)作為信號(hào)分子出現(xiàn)，可以直接激活雷帕霉素復(fù)合體(mTOR)途徑的機(jī)制靶點(diǎn)，從而調(diào)控反芻動(dòng)物組織蛋白質(zhì)的合成[27]。以往研究表明，飼喂低蛋白飼糧會(huì)通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路從而減少蛋白質(zhì)合成[28]。本研究結(jié)果顯示，LCD組相比于HCD組顯著降低了mTOR蛋白表達(dá)水平，與以往的研究結(jié)果相一致。HCD組促進(jìn)了p-mTOR、p-4EBP和S6K1基因磷酸化，因?yàn)镠CD組顯著增加了肌肉中亮氨酸濃度。亮氨酸作為反芻動(dòng)物的必需氨基酸，可以調(diào)節(jié)機(jī)體的蛋白質(zhì)代謝，促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)合成[29]。而mTOR信號(hào)通路在蛋白質(zhì)合成和促進(jìn)細(xì)胞翻譯中發(fā)揮重要作用[30]。這可能是亮氨酸進(jìn)一步激活了mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)了下游因子S6K1和4E-BP1磷酸化，從而促進(jìn)肌肉中蛋白質(zhì)的合成[31]。

FOX是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，可以調(diào)控肌肉蛋白質(zhì)降解，近年來(lái)不斷有新的亞型被報(bào)道。FOX蛋白對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有2種方式，一種是吸引共激活因子協(xié)同調(diào)控；另一種是直接結(jié)合染色體重塑染色體結(jié)構(gòu)，改變相應(yīng)基因的表達(dá)量[32]。該蛋白自身的活性也受其他途徑調(diào)節(jié)，其中較為重要的調(diào)節(jié)效果是磷酸化反應(yīng)[33]。FOXO1是FOX家族中最早發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞分化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。其后在FOXO1的基因結(jié)合結(jié)構(gòu)域同系物研究中發(fā)現(xiàn)了FOXO3a，與FOXO1具有高度同源性[34-35]。FOXO1調(diào)控機(jī)制主要表現(xiàn)在對(duì)肉質(zhì)的調(diào)控。在牛羊等動(dòng)物上均有報(bào)道FOXO1通過(guò)去磷酸化作用，抑制肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的增殖分化，影響肉品質(zhì)[36]。HCD組FOXO1和p-FOXO3a基因極顯著高于LCD組，說(shuō)明有可能HCD組牛肉品質(zhì)較好，具體還需要進(jìn)一步測(cè)定肉品質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。FOXO基因在多種組織中具有廣泛的表達(dá)，發(fā)揮了重要的作用，具體怎樣在牛的肌肉組織中發(fā)揮作用將成為下一步的研究?jī)?nèi)容：揭示FOXO基因調(diào)控肉牛的作用機(jī)制。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，NFC/NDF比值為4.05的高精料飼糧，肌肉氨基酸含量豐富，肉的風(fēng)味品質(zhì)好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高；還能夠提高mTOR通路中S6K1磷酸化水平,促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)合成，提高蛋白質(zhì)的利用效率。