唐 燕，羅勝繽，孫旭東，徐 闖

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

酮病是奶牛圍產(chǎn)期常見(jiàn)的代謝性疾病，由于泌乳所需能量增加而干物質(zhì)攝入量(dry matter intake，DMI)降低，通常表現(xiàn)出能量負(fù)平衡(negative energy balance，NEB)[1]。為適應(yīng)NEB，機(jī)體啟動(dòng)脂肪動(dòng)員產(chǎn)生大量游離脂肪酸以滿(mǎn)足能量需求[2]，進(jìn)而產(chǎn)生大量酮體，導(dǎo)致高酮血癥從而引發(fā)酮病。酮病奶牛處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，且與酮病奶牛代謝產(chǎn)生的高濃度酮體密切相關(guān)。此外，高濃度的酮體可引起奶牛乳腺組織氧化應(yīng)激并造成氧化損傷[3]，進(jìn)而影響奶牛乳腺組織的泌乳功能，最終導(dǎo)致產(chǎn)奶量降低和乳品質(zhì)下降，嚴(yán)重制約我國(guó)奶業(yè)的發(fā)展。乙酰乙酸(acetoacetic acid,ACAC)是奶牛體內(nèi)酮體的主要形式之一，高濃度的ACAC可促進(jìn)ROS的產(chǎn)生誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[4]。乳腺上皮細(xì)胞是奶牛乳腺組織泌乳的基本功能單位，維持其正常生理功能對(duì)奶牛生產(chǎn)性能至關(guān)重要。因此，如何緩解奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷并探索其潛在治療靶點(diǎn)及藥物是我國(guó)奶業(yè)發(fā)展的迫切需求。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-reated factor 2,Nrf2)是一種參與調(diào)控細(xì)胞氧化還原平衡的轉(zhuǎn)錄激活因子[5]。目前，Nrf2是研究細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)分子機(jī)制的熱門(mén)靶點(diǎn)。通常，Nrf2與細(xì)胞質(zhì)中的Kelch-like ECH相關(guān)蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)以復(fù)合物形式存在[6]。在細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2從Keap1中釋放出來(lái)并移位到細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responseelement，ARE)結(jié)合，激活包括NQO1和HO-1在內(nèi)的細(xì)胞抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[7-8]，從而發(fā)揮抗氧化作用。據(jù)報(bào)道，激活Nrf2信號(hào)通路可以緩解H2O2誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激[9-10]。

蘿卜硫素(SFN)是存在于花椰菜等十字花科蔬菜中的一種天然的異硫氰酸酯，在抗氧化、抗炎等細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[11]。此外，SFN是Nrf2的天然植物化學(xué)激活劑，因其對(duì)氧化應(yīng)激和慢性炎癥引起的疾病可起到預(yù)防和治療作用[12]，被廣泛應(yīng)用于食品添加劑。與其他植物源性的化學(xué)補(bǔ)充劑(如姜黃素、水飛薊素和白藜蘆醇)相比，SFN可以更有效地激活Nrf2，誘導(dǎo)一系列細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)[13]。發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，SFN可激活Nrf2/ARE抗氧化途徑，從而促進(jìn)抗氧化基因的表達(dá)，如HO-1和NQO1等[14]。研究表明，SFN可通過(guò)促進(jìn)Nrf2的核移位來(lái)緩解H2O2誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[15]。這些研究說(shuō)明SFN可以通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路從而緩解氧化應(yīng)激，但尚不清楚SFN是否可以通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路從而緩解ACAC誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激。

因此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞系MAC-T添加不同濃度的ACAC，建立酮病奶牛氧化應(yīng)激模型，并添加10 μmol/L的SFN，檢測(cè)Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)情況及其下游基因HO-1和NQO1基因表達(dá)水平，并檢測(cè)ROS和MDA的含量及SOD和GSH-Px的活性，旨在探討SFN保護(hù)奶牛乳腺上皮細(xì)胞免受ACAC誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的分子調(diào)控機(jī)制，為防治酮病奶牛代謝應(yīng)激導(dǎo)致的乳腺組織氧化損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器DMEM-F12培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(CLARK公司)；RIPA細(xì)胞組織裂解液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒和ROS檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天公司；TRIzol和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa；SYBR green plus(Roche，Norwalk，CT)；MDA含量檢測(cè)試劑盒及SOD和GSH-Px活性檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Nrf2抗體(Abcam)；GAPDH抗體(absin)；二抗(博士德)；ECL化學(xué)發(fā)光溶液(Pierce Biotechnology Inc.)；流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，Becton Dickinson)；722N分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司)；熒光定量PCR儀(7500 Real-Time PCR系統(tǒng)Applied Biosystems)；Amersham Imager 600化學(xué)發(fā)光成像儀(美國(guó)GE的Fujifilm光學(xué)系統(tǒng))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理本試驗(yàn)使用的奶牛乳腺上皮細(xì)胞系(MAC-T)購(gòu)自上海傳秋生物科技有限公司。用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)MAC-T，每隔24 h更換培養(yǎng)基1次。用0，0.6，1.2，1.8 mmol/L ACAC分別處理MAC-T細(xì)胞24 h。用10 μmol/L SFN處理MAC-T細(xì)胞24 h后再用1.2 mmol/L ACAC處理24 h。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1ROS的測(cè)定 采用DCFH-DA染色法檢測(cè)ROS。用25 μmol/L DCFH-DA處理細(xì)胞并孵育20 min,然后用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，收集細(xì)胞重新懸浮于臺(tái)式液中，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光,細(xì)胞內(nèi)ROS濃度為相對(duì)熒光。

1.3.2氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定 將原細(xì)胞培養(yǎng)液棄掉后每孔加入1 mL PBS清洗，然后收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞中MDA的含量，使用722N分光光度計(jì)在532 nm(MDA)處讀取D值；根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)GSH-Px和SOD的活性，分別在560 nm(SOD)和420 nm(GSH-Px)處讀取D值。

1.3.3RNA分離和實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR) 細(xì)胞在六孔板中處理結(jié)束后，按照每孔1 mL的量加入TRIzol，用移液槍吹打數(shù)次并收集細(xì)胞于無(wú)RNA酶的EP管中。之后按照加入氯仿抽提—離心—加入異丙醇沉淀—離心—酒精洗滌—離心的步驟提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)RNA濃度，將1 μg RNA樣品使用試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR green plus試劑盒在7500 Real-Time PCR系統(tǒng)檢查靶基因的表達(dá)量；在Excel軟件中用2-△△Ct方法計(jì)算目的基因的表達(dá)水平。本研究中所用全部引物見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR分析所用引物

1.3.4Western blot 細(xì)胞處理結(jié)束后收集細(xì)胞，加入適量細(xì)胞組織裂解液RIPA，振蕩后在冰上靜置，10 min/次，共振蕩3次。振蕩結(jié)束后將懸液離心并收集上清液，按照BCA法的步驟測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度并調(diào)整質(zhì)量濃度加入loading buffer制成蛋白樣品。使用10%濃度的SDS-PAGE將30 μg蛋白在80 V、30 min和120 V、60 min條件下電泳分離。將完成電泳后的目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，然后將膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫條件下封閉2 h。4℃搖床孵育一抗過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后，使用含1%Tween 20和10%TBS的TBST緩沖溶液洗滌5次，每次5 min；然后在室溫條件下水平搖床孵育二抗1 h；TBST洗滌5次，每次5 min；最后在Amersham Imager 600化學(xué)發(fā)光成像儀中將膜曝光成像。將得到的目的蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較后制作成柱狀圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用IBM SPSS Statistics 26.0軟件對(duì)各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，各組間的顯著性差異用字母表示(P<0.05)，數(shù)據(jù)表示形式為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果

2.1 ACAC誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激與對(duì)照組相比，1.2，1.8 mmol/L ACAC處理組MAC-T細(xì)胞中ROS和MDA含量顯著升高(圖1，P<0.05)，而SOD和GSH-Px的活性顯著降低(圖2，P<0.05)。

A.ROS含量；B.MDA含量。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 SFN預(yù)處理緩解ACAC對(duì)Nrf2信號(hào)通路活性的抑制作用與DMSO組相比，ACAC+DMSO處理組的Nrf2蛋白水平顯著降低(圖3A，B;P<0.05)。然而，與DMSO組相比，SFN處理組Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高(圖3，P<0.05)。與ACAC+DMSO處理組相比，ACAC+SFN處理組Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高(圖3,P<0.05)。與DMSO組相比，ACAC+DMSO處理組的Nrf2下游基因HO-1和NQO1 mRNA表達(dá)量顯著降低(圖4,P<0.05)。與DMSO組相比，SFN處理組HO-1和NQO1 mRNA的表達(dá)量顯著升高(圖4,P<0.05)；與ACAC+DMSO處理組相比，ACAC+SFN處理組HO-1和NQO1 mRNA表達(dá)量顯著升高(圖4A,B；P<0.05)。

A.Nrf2蛋白表達(dá)；B.Nrf2蛋白相對(duì)水平

A.HO-1基因表達(dá)水平；B.NQO1基因表達(dá)水平

2.3 SFN預(yù)處理緩解ACAC誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與DMSO組相比，ACAC+DMSO處理組的MAC-T細(xì)胞中的ROS和MDA含量顯著升高(圖5,P<0.05)，而SOD和GSH-Px的活性顯著降低(圖6,P<0.05)。與ACAC+DMSO處理組相比，ACAC+SFN處理組的MAC-T細(xì)胞中的ROS和MDA的含量顯著降低(圖5,P<0.05)，而SOD和GSH-Px的活性顯著升高(圖6,P<0.05)。

A.ROS含量；B.MDA含量。

A.SOD活性；B.GSH-Px活性

3 討論

酮病奶牛乳腺組織存在嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷，降低奶牛泌乳性能[3]。因此，增強(qiáng)奶牛乳腺組織的抗氧化能力是緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的氧化損傷以及增強(qiáng)泌乳性能的有效治療策略。SFN是一種廣泛存在于十字花科蔬菜家族的Nrf2的天然激活劑，具有很強(qiáng)的抗氧化作用[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，SFN具有激活Nrf2信號(hào)通路來(lái)抵抗ACAC誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的生物學(xué)活性。因此，我們推測(cè)SFN可能是一種潛在的預(yù)防和治療反芻動(dòng)物氧化損傷的藥物。

酮病奶牛泌乳早期因發(fā)生NEB存在嚴(yán)重的代謝應(yīng)激[17]。此時(shí)，因泌乳所需能量大幅提高，大量游離脂肪酸和酮體隨血液進(jìn)入乳腺組織以滿(mǎn)足能量需求[18]。ACAC是酮體的主要形式之一，高濃度酮體導(dǎo)致奶牛乳腺組織氧化損傷[19-20]，損害乳腺泌乳功能。這是由于大量酮體誘導(dǎo)過(guò)量的ROS產(chǎn)生導(dǎo)致抗氧化能力降低造成氧化還原失衡從而引發(fā)氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生氧化對(duì)周?chē)M織造成實(shí)質(zhì)性的損害[21]。因此，對(duì)于圍產(chǎn)期奶牛而言，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡是抵御氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的關(guān)鍵所在。SFN是一種PhaseⅡ型酶的天然誘導(dǎo)劑，能有效地誘導(dǎo)HO-1和NQO1等抗氧化酶，增強(qiáng)細(xì)胞和器官抵御各種氧化應(yīng)激損傷的抗氧化能力[22-23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，SFN預(yù)處理緩解了ACAC對(duì)抗氧化酶SOD和GSH-Px活性的抑制作用，并增強(qiáng)了HO-1和NQO1基因的表達(dá)，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了SFN有益于增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的防御能力。此外，ROS和MDA濃度降低也說(shuō)明了SFN可增強(qiáng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化能力，從而緩解ACAC誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。然而，目前尚不清楚ACAC誘導(dǎo)的MAC-T氧化應(yīng)激模型是否能夠模擬圍產(chǎn)期酮病奶牛體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。因此，應(yīng)進(jìn)一步研究SFN對(duì)酮病奶牛乳腺組織氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用。

SFN的抗氧化能力源于激活Nrf2信號(hào)通路以促進(jìn)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[24]。內(nèi)源性抗氧化防御機(jī)制包括SOD、GSH-Px和HO-1等多種Ⅱ相抗氧化酶[25-26]。這些抗氧化酶的表達(dá)受抗氧化反應(yīng)原件ARE啟動(dòng)子序列的調(diào)控，而ARE受Nrf2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[27]。Nrf2必須移位到細(xì)胞核中與ARE結(jié)合才能啟動(dòng)Ⅱ相抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄[28]。有研究表明，SFN通過(guò)激活Nrf2-ARE途徑，上調(diào)抗氧化酶基因的表達(dá)清除過(guò)多的ROS，來(lái)保護(hù)顆粒細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[29]。ZHAO等[30]發(fā)現(xiàn),SFN通過(guò)激活Nrf2來(lái)激活HO-1，減輕膿毒癥導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，從而緩解大鼠急性肺損傷。CHEN等[31]研究表明，SFN通過(guò)誘導(dǎo)Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)保護(hù)神經(jīng)嵴細(xì)胞抵御乙醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。以上結(jié)果都強(qiáng)調(diào)了SFN通過(guò)激活Nrf2途徑來(lái)抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化損傷的作用。在本試驗(yàn)中，SFN預(yù)處理減弱了ACAC對(duì)Nrf2的表達(dá)以及Nrf2下游基因HO-1和NQO1的mRNA水平的抑制作用,并且SFN預(yù)處理降低了活性氧ROS和細(xì)胞毒性產(chǎn)物MDA含量，也提升了細(xì)胞的抗氧化酶活性。這些結(jié)果說(shuō)明SFN可以通過(guò)激活Nrf2，從而增強(qiáng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化能力來(lái)緩解氧化應(yīng)激，與其他研究的結(jié)果是一致的。因此，本試驗(yàn)的結(jié)果表明SFN通過(guò)激活Nrf2增加抗氧化酶活性來(lái)減輕ACAC誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激。目前，SFN提取純化工藝的發(fā)展日益成熟，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[32]。因此SFN作為天然植物的抗氧化性膳食補(bǔ)充劑，具備良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景并為未來(lái)奶牛臨床疾病的防治提供了新的方向和手段。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，SFN可以緩解ACAC誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激。SFN通過(guò)增加Nrf2的蛋白表達(dá)及其下游基因HO-1和NQO1的mRNA水平，并增強(qiáng)抗氧化酶活性，降低ROS和細(xì)胞毒性產(chǎn)物MDA的含量，從而發(fā)揮抗氧化作用。綜上，SFN通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路，增加抗氧化基因的表達(dá)并增強(qiáng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化能力，緩解ACAC誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激。