李 通，孟衛(wèi)芹，馬 力，陳金龍，沈志強(qiáng),3，王金良*，韓先杰*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；3.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；4.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)又稱魏氏梭菌，是一種革蘭陽性、可以產(chǎn)生芽孢的粗桿狀厭氧菌。該菌對營養(yǎng)條件要求較低，廣泛存在于空氣、水、土壤、食品及動(dòng)物的胃腸道中，是自然界中常見的條件性致病菌，動(dòng)物抵抗力下降時(shí)即可引起發(fā)病[1-3]，其可引起羊腸毒血癥、羔羊痢疾、羊猝狙等，嚴(yán)重影響畜禽的健康養(yǎng)殖,同時(shí)也對人類健康造成極大威脅[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素有12種(α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ和ν)，其中最主要外毒素為α、β、ε、ι等4種，根據(jù)這4種主要外毒素可將Clostridiumperfringens分為A、B、C、D、E共5種基因型，近年來相關(guān)研究又增加了F、G這2種基因型[6-8]。α毒素(cpa)是所有類型產(chǎn)氣莢膜梭菌均可產(chǎn)生的細(xì)菌外毒素蛋白，是產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的重要的皮膚壞死性、致死性毒素之一，該毒素同時(shí)具有鞘磷脂酶和磷脂酶C 2種酶活性且有毒素活性，其可進(jìn)入血液循環(huán)引起動(dòng)物敗血癥或毒血癥，從而導(dǎo)致急性死亡[9-10]。

目前，羊三聯(lián)四防疫苗在羊產(chǎn)氣莢膜梭菌的防制過程中起到積極的作用。自繁自養(yǎng)的規(guī)模化羊場依據(jù)疫苗免疫程序，能夠很好地控制該病的發(fā)生。異地育肥的羊群，因羊源不同，導(dǎo)致疫苗免疫時(shí)間不一致，進(jìn)而羊群中疫苗抗體的水平參差不齊，時(shí)有產(chǎn)氣莢膜梭菌病的發(fā)生，并造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，急需一種可以用于疫苗免疫后抗體評價(jià)的方法，用于指導(dǎo)疫苗的免疫。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-α702，通過E.coliRosetta(DE3)大腸桿菌實(shí)現(xiàn)了對α毒素基因的截短表達(dá)(101 aa～334 aa)。以純化、復(fù)性后的α毒素截短蛋白作為抗原，優(yōu)化相關(guān)條件建立了羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌 α毒素抗體間接ELISA檢測方法，可用于羊群免疫產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗后的抗體水平評估，為產(chǎn)氣莢膜梭菌病防制及該菌的流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支持和物質(zhì)保障。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DL2000 DNA Marker,購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；DL8000 DNA Marker,北京全式金生物公司產(chǎn)品；蛋白Marker、預(yù)染蛋白Marker,購自賽默飛公司；PCR Mix、E.coliDH5α、E.coliRosetta(DE3)、pET32a(+)、pMD18-T、T4DNA Ligase、BamHⅠ、SalⅠ,寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA提取與DNA回收試劑盒購、質(zhì)粒提取試劑盒,購自O(shè)mega公司；DAB底物顯色液,購自Proteintech公司；TMB單組分顯色液,購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗羊HRP-IgG,購自Sigma公司；96孔酶標(biāo)板,購自BIOFIL公司。

1.2 試驗(yàn)樣品A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(CVCC37)，羊產(chǎn)氣莢膜梭菌陰性、陽性血清，口蹄疫病毒(FMDV)、小反芻獸疫病毒(PPRV)、羊痘病毒(SPV)陽性血清，均由本實(shí)驗(yàn)室保存；226份臨床血清樣品，山東羊養(yǎng)殖區(qū)收集。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成參考GenBank公布的大小為1 197 bp的α毒素基因全序列(MW665544.1)，使用DNAStar對其氨基酸序列的抗原決定簇抗原性進(jìn)行分析；選擇大小為702 bp的基因序列(101 aa～334 aa)，使用Primer 5.0添加酶切位點(diǎn)、保護(hù)性堿基進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。其中上游引物F：TATCGG-GATCCGATACAGATAATAATTTC(下劃線部分為BamHⅠ位點(diǎn))；下游引物R：AAGCTT-GTCGACGAGTGTCTTTACTTC(下劃線部分為SalⅠ位點(diǎn))，引物由通用生物(安徽)有限公司合成。

1.4 α毒素截短基因的克隆將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株接種液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，在43℃厭氧條件下培養(yǎng)12 h。使用DNA提取試劑盒提取DNA，以其為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：PCR Mix(2×)10 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，4℃終止。1%瓊脂糖電泳后進(jìn)行膠回收，連接pMD18-T載體送通用生物(安徽)有限公司測序。將測序結(jié)果使用DNAStar軟件與參考α毒素基因序列進(jìn)行比對分析，確認(rèn)序列正確后使用BamHⅠ、SalⅠ對pMD18-T-α702進(jìn)行雙酶切，獲得酶切α702基因片段。

1.5 重組載體的構(gòu)建與鑒定利用BamHⅠ、SalⅠ雙酶切pET32a(+)質(zhì)粒，1%凝膠電泳后進(jìn)行膠回收。將酶切回收后的α702基因片段、pET32a(+)質(zhì)粒使用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑取單菌落搖菌，進(jìn)行菌液PCR鑒定，提取質(zhì)粒酶切鑒定獲得重組表達(dá)載體pET32a-α702。

1.6 重組蛋白的原核表達(dá)、純化及復(fù)性pET32a-α702重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliRosetta(DE3)大腸桿菌，使用氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選，挑取單菌落搖菌過夜。將菌液按1%接種氨芐抗性LB培養(yǎng)基搖菌至D600 nm=0.6，加IPTG至終濃度100 μmol/L，37℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)5 h。培養(yǎng)液10℃、8 000 r/min離心3 min，使用PBS重懸菌體并超聲破碎，離心保留上清，沉淀使用PBS洗滌1次，離心棄上清，使用8 mol/L尿素溶解沉淀。將上清、沉淀進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳分析。對蛋白溶液使用0.45 μm濾膜過濾，以鎳離子親和層析法進(jìn)行純化，純化的蛋白置于透析袋中，在冰浴條件下使用磁力攪拌器梯度透析。測定純化蛋白濃度，加入適量甘油置于-40℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 重組蛋白Western blot鑒定將重組蛋白稀釋至1 g/L進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，按照NC膜表面積(cm2)的5倍確定電流(mA)大小，轉(zhuǎn)膜25 min。以含有5%的脫脂奶粉的TBST Buffer在4℃封閉12 h；用TBST Buffer 清洗3次，每次10 min；加1∶1 000的帶辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗His標(biāo)簽抗體在37℃溫箱孵育30 min；TBST Buffer清洗3次，每次10 min；DAB底物顯色液常溫避光顯色1 min。

1.8 ELISA方法建立

1.8.1最佳包被質(zhì)量濃度、包被條件 對純化蛋白進(jìn)行梯度稀釋(4.00，2.00，1.00，0.50，0.25 mg/L)，在酶標(biāo)板上添加100 μL/孔，使用4℃ 12 h、37℃ 2 h 2種條件包被。以陰性、陽性血清1∶100，37℃孵育30 min；二抗1∶2 000，37℃孵育30 min；37℃顯色10 min進(jìn)行測試。測定D450 nm/D630 nm(以630 nm 作為參比波長)值，選擇P/N值最大為最佳抗原包被質(zhì)量濃度。

1.8.2最佳樣品稀釋度、二抗?jié)舛燃胺磻?yīng)時(shí)間 對羊產(chǎn)氣莢膜梭菌陰性、陽性血清進(jìn)行稀釋(1∶25,1∶50,1∶100,1∶200,1∶400)添加100 μL/孔，反應(yīng)時(shí)間選擇30,40,50,60 min進(jìn)行測試。對兔抗羊HRP-IgG二抗進(jìn)行稀釋(1∶1 000,1∶2 500,1∶5 000,1∶10 000)添加100 μL/孔，反應(yīng)時(shí)間選擇30,40,50,60 min進(jìn)行測試。測定D450 nm/D630 nm值，選陽性血清D450 nm/D630 nm值在1左右為最佳樣品稀釋度、二抗?jié)舛燃胺磻?yīng)時(shí)間。

1.8.3最佳顯色時(shí)間 添加底物液50 μL/孔，以不同顯色時(shí)間(5,10,15 min)，在37℃下進(jìn)行顯色，測定D450 nm/D630 nm值，分析確定間接ELISA方法的最佳顯色時(shí)間。

1.8.5敏感性試驗(yàn) 選取羊產(chǎn)氣莢膜梭菌陰性、陽性血清進(jìn)行稀釋(1∶50,1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1 600)，使用建立的方法進(jìn)行檢測3次，根據(jù)陽性血清的最大稀釋倍數(shù)評價(jià)該間接ELISA方法的敏感性。

1.8.6特異性試驗(yàn) 選擇羊產(chǎn)氣莢膜梭菌陰性、陽性血清，F(xiàn)MDV、PPRV、SPV陽性血清，用建立的的間接ELISA方法檢測，以評價(jià)其特異性。

1.8.8臨床血清樣本的檢測 用建立的間接ELISA方法對山東某羊養(yǎng)殖區(qū)收集的226份臨床羊血清進(jìn)行檢測，以此來評估本地區(qū)羊群α毒素抗體水平。從檢出的臨床陽性血清、陰性血清中各隨機(jī)選取20份，用產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體經(jīng)典檢測方法[11]進(jìn)行復(fù)核檢測，被檢血清用生理鹽水進(jìn)行2倍稀釋后，取0.1 mL與小鼠1個(gè)最小致死量的α毒素混合，加生理鹽水至終體積0.5 mL，37℃反應(yīng)2 h后，健康小鼠腹腔注射0.5 mL/只，重復(fù)3次；對照組為無菌生理鹽水代替稀釋后的血清；注射48 h后進(jìn)行觀察記錄，若生理鹽水對照組全部死亡，血清中和試驗(yàn)組存活小鼠≥2只則判定為血清抗體陽性，存活小鼠<2只則判定為抗體陰性。

2 結(jié)果

2.1 重組載體的構(gòu)建、鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳可見單一明亮條帶，約為702 bp，與預(yù)期條帶大小相符(圖1)。pMD18-T-α702載體測序結(jié)果分析，基因序列準(zhǔn)確無誤。構(gòu)建的pET32a-α702重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ雙酶切驗(yàn)證可見約702 bp的目的基因(圖2)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DL2000 DNA Marker；1.α毒素基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對照

M.DL8000 DNA Marker；1.pET32a(+)的BamHⅠ、SalⅠ雙酶切；2.重組質(zhì)粒的BamHⅠ、SalⅠ雙酶切

2.2 α毒素截短基因的原核表達(dá)及鑒定12%SDS-PAGE電泳結(jié)果表明目的蛋白主要以包涵體形式存在，約為43 kDa，與預(yù)測蛋白大小相符(圖3)；使用鎳離子親和層析法進(jìn)行純化，測定純化蛋白質(zhì)量濃度為5.1 g/L(圖4)；Western blot結(jié)果顯示在43 kDa處有特異性條帶出現(xiàn)(圖5)。

M.蛋白Marker；1.重組菌誘導(dǎo)后沉淀；2.重組菌誘導(dǎo)后上清；3.重組菌誘導(dǎo)前沉淀；4.重組菌誘導(dǎo)前上清；5.空質(zhì)粒菌誘導(dǎo)后沉淀；6.空質(zhì)粒菌誘導(dǎo)后上清；7.空質(zhì)粒菌誘導(dǎo)前沉淀；8.空質(zhì)粒菌誘導(dǎo)前上清

M.蛋白Marker；1.空白；2.純化蛋白

M.預(yù)染蛋白Marker；1.純化蛋白與帶HRP標(biāo)記的鼠抗His標(biāo)簽抗體反應(yīng)；2.空白對照

2.3 ELISA方法的建立

2.3.1反應(yīng)條件的優(yōu)化 根據(jù)相關(guān)結(jié)果篩選最優(yōu)間接ELISA條件為蛋白包被質(zhì)量濃度2 mg/L，4℃包被12 h；血清1∶50稀釋，37℃孵育40 min；二抗1∶2 500稀釋，37℃孵育40 min；37℃顯色10 min。

2.3.3敏感性試驗(yàn) 使用建立的方法檢測陰性、陽性血清，陽性血清稀釋至400倍D450 nm/D630 nm值仍大于臨界值，陰性血清D450 nm/D630 nm值始終低于臨界值(圖6)，表明該方法的敏感性較高。

圖6 敏感性試驗(yàn)

2.3.4特異性試驗(yàn) 使用建立的方法對FMDV、PPRV、SPV陽性血清，羊產(chǎn)氣莢膜梭菌陰性、陽性血清進(jìn)行檢測，羊產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清檢測結(jié)果為陽性，其余均為陰性，證明該方法的檢測特異性良好。

2.3.5重復(fù)性試驗(yàn) 使用建立的方法對8份血清進(jìn)行檢測，批內(nèi)變異系數(shù)在2.57%～7.69%之間(表1)，批間變異系數(shù)在4.38%～7.78%之間(表2)，均小于10%，證明該方法的重復(fù)性較好。

表1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

表2 批間重復(fù)性試驗(yàn)

2.3.6臨床血清樣本檢測 使用建立的ELISA方法對226份來自山東羊養(yǎng)殖區(qū)收集的臨床羊血清樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果162份α毒素抗體為陽性、64份為陰性，陽性率為71.68%。隨機(jī)選取20份陰性血清、20份陽性血清的復(fù)核檢測中，小鼠毒素中和試驗(yàn)檢出血清陽性17份，陰性23份，2種方法符合率92.50%。

3 討論

羊產(chǎn)氣莢膜梭菌病一直以來都是影響羊養(yǎng)殖行業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一，其發(fā)病急、死亡快、難于救治往往給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。近年來,伴隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥性日益嚴(yán)重，眾多臨床毒株逐漸出現(xiàn)了多重耐藥性，強(qiáng)毒株的進(jìn)化與快速適應(yīng)對羊養(yǎng)殖業(yè)和人類健康造成重大威脅[12]。免疫接種是防治羊產(chǎn)氣莢膜梭菌病最直接有效的措施，“三聯(lián)四防”等疫苗在當(dāng)前羊養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛、效果顯著，但接種疫苗后仍需對羊群免疫效果進(jìn)行檢測評估，并定期進(jìn)行加強(qiáng)免疫以維持免疫效果[13-14]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素是一種依賴于Zn2+的多功能金屬酶，其具有細(xì)胞毒性、溶血活性、皮膚壞死性、血小板聚集和增加血管滲透性等特性[15]。該毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌致病的一種重要的共有外毒素，其可突破機(jī)體的防御屏障，入侵血液循環(huán)系統(tǒng)，造成毒血癥或敗血癥，導(dǎo)致患病動(dòng)物全身衰竭死亡。α毒素作為產(chǎn)氣莢膜梭菌各型共有的外毒素，是疫苗制備過程中重要的有效抗原成分，該毒素抗體檢測方法的建立在疾病的準(zhǔn)確診斷、疫苗免疫效果評價(jià)方面具有重要意義，對產(chǎn)氣莢膜梭菌病的控制具有重要的指導(dǎo)作用。同批次羊只α毒素抗體的整齊度，可以作為評價(jià)羊群感染羊產(chǎn)氣莢膜梭菌病的重要參考依據(jù)[16-17]。α毒素抗體傳統(tǒng)檢測方法有小鼠毒素中和試驗(yàn)、卵磷脂水解抑制試驗(yàn)等。小鼠毒素中和試驗(yàn)是檢測α毒素抗體的最經(jīng)典方法，雖然特異性高準(zhǔn)確可靠，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于操作；卵磷脂水解抑制試驗(yàn)敏感性較低，操作繁瑣重復(fù)性較差，不利于推廣使用[18]，并且以上試驗(yàn)均需進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)獲得α毒素，對檢測的平臺與環(huán)境有一定要求。ELISA檢測技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作方便、重復(fù)性好、檢測通量高等特點(diǎn)，檢測的數(shù)據(jù)可進(jìn)行計(jì)算分析，用于輔助疾病的預(yù)防控制，且其對檢測人員和檢測平臺無特殊要求，適合各類實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。

本試驗(yàn)通過對產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因進(jìn)行截短原核表達(dá)，獲得了表達(dá)量高，穩(wěn)定性好的檢測抗原，較產(chǎn)氣莢膜梭菌活菌培養(yǎng)分離外毒素方法更為簡便，適于批量制備。基于原核表達(dá)的蛋白建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體間接ELISA方法為羊群產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗免疫后抗體水平監(jiān)測提供了一種便捷、穩(wěn)定、高效的血清學(xué)檢測方法，為開展α毒素抗體水平的臨床檢測提供了技術(shù)支持，進(jìn)一步豐富了產(chǎn)氣莢膜梭菌病的綜合防控技術(shù)。