尚再卓，于瑞明，張莉萍，王永錄，潘 麗，杜曉華，劉 霞*，劉新生*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 生命科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070)

豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一種新型豬腸道冠狀病毒，主要引起哺乳仔豬嘔吐、腹瀉、脫水和死亡。2012年，WOO等[1]在對香港地區(qū)動物樣品進行冠狀病毒的檢測中發(fā)現(xiàn)了PDCoV。DONG等[2]分析了2004-2014年間我國多個省份規(guī)?；i場的215份糞便樣品，首次證實我國內(nèi)地豬場中PDCoV的存在。2014年，PDCoV在美國俄亥俄州、愛荷華州、伊利諾伊州及明尼蘇達州等多地的豬場暴發(fā)[3-5]，隨后在腹瀉仔豬腸道內(nèi)容物和LLC-PK細胞中首次分離出PDCoV OH-FD22株[6]。隨后，加拿大、韓國、泰國、老撾、越南、日本等許多國家報道了PDCoV感染的存在[7-12]。近年來，我國多個省份均有PDCoV疫情的相關(guān)報道，并呈逐年增長的趨勢，且PDCoV與其他豬腸道病原共感染的現(xiàn)象也較為普遍[13]，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[14]。目前，針對此病尚無特效治療藥物及疫苗免疫方法，也無市售商品化PDCoV特異性抗體ELISA檢測試劑盒。因此，建立一種速度快、靈敏度高、特異性強的ELISA方法，對PDCoV的臨床診斷及免疫防控具有重要意義。

PDCoV是單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科、δ冠狀病毒屬，病毒顆粒呈球形或多型性，病毒直徑約為100 nm，有囊膜和許多末端凸起的纖突，基因組大小為25.4 kb，是目前發(fā)現(xiàn)最小的冠狀病毒成員[15]。與其他冠狀病毒一樣，PDCoV也含有4種主要結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)。其中 S蛋白在病毒與細胞受體結(jié)合，介導病毒入侵和感染中發(fā)揮重要作用[16]；同時，S蛋白也是病毒誘導機體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原[17]。SHANG等[18]用冷凍電鏡技術(shù)解析了S蛋白的三維結(jié)構(gòu)與功能,結(jié)果顯示S蛋白由非共價連接的S1、S2兩部分組成，S1包含 N末端受體結(jié)構(gòu)域(NTD)和C末端受體結(jié)構(gòu)域(CTD)，而S1-CTD區(qū)域能夠與宿主表面的未識別受體結(jié)合，推測該段包含主要RBD(受體結(jié)合區(qū)域)。因此，截短的S1-CTD蛋白可以作為建立ELISA檢測方法的理想抗原。

PDCoV是一種腸道病原體，主要通過呼吸道和消化道進行傳播，從而引起黏膜處上皮細胞的病變[15]。SIgA(分泌性IgA)是腸黏膜的主要免疫球蛋白，是維持腸道黏膜穩(wěn)態(tài)的第一道防線，對腸道內(nèi)的共生菌及入侵病原體具有抵御作用[19]。有研究表明，血清特異性IgA 抗體水平與局部黏膜免疫水平呈正相關(guān)，可在病毒感染或接種疫苗的豬血清和乳汁中檢測到[20]。目前，豬傳染性胃腸炎[21]、豬流行性腹瀉[22]、豬繁殖與呼吸綜合征[23]等傳染病通過黏膜免疫均取得了很好的免疫保護效果，黏膜免疫主要效應(yīng)因子SIgA已成為檢測和判斷黏膜免疫抗病毒水平的重要指標[24]。然而，現(xiàn)有的ELISA檢測方法主要是檢測血清中特異性IgG抗體，對PDCoV黏膜免疫水平的檢測方法和評判標準未見報道。因此，本試驗以大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的PDCoV S1-CTD蛋白作為包被抗原，建立了能夠檢測血清PDCoV特異性IgA抗體的間接ELISA方法，為臨床上監(jiān)測母豬和仔豬血清中IgA抗體水平及評價疫苗免疫效果提供了新的方法。

1 材料與方法

1.1 病毒、血清及主要試劑PDCoV陽性血清采自本實驗室攻毒7 d的仔豬，陰性血清采自甘肅臨洮豬場未免疫母豬；豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬嵴病病毒(PKV)、口蹄疫病毒(FMDV)及豬瘟病毒(CSFV)的陽性血清由本實驗室保存；E.coliDH5α感受態(tài)細胞、BL21(DE3)感受態(tài)細胞、Premix TaqTM酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；T4DNA連接酶、NheⅠ限制性內(nèi)切酶和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs(NEB)公司；96孔酶標板、山羊抗豬IgA-HRP購自北京索萊寶生物科技有限公司；AxyPrepTMDNA 凝膠回收試劑盒、AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit購自Axygen公司；酶標儀購自美國Bio-Rad Laboratories公司；血清稀釋液、百迪泰酶標抗體穩(wěn)定劑、單組份TMB底物顯色液及終止液購自濟南百迪泰生物科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計截取優(yōu)化后S基因中的抗原表位區(qū)CTD片段，利用SnapGene軟件設(shè)計特異性引物，在上、下游引物中分別引入限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ(引物處下劃線序列)，S1-CTD-F:5′-CCGCTAGCCAACGTACTATTGTCACACTAC-C-3′;S1-CTD-R:5′-GGCTCGAGGCAGACATCA-GTGATTACACTAG-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3S1-CTD基因原核表達載體的構(gòu)建及鑒定以S基因為模板，S1-CTD-F、S1-CTD-R為引物，擴增S1-CTD基因；目的基因于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳檢測后，按膠回收試劑盒的說明書進行純化，并將純化產(chǎn)物及原核表達載體pET24a(+)用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ酶切，酶切產(chǎn)物鑒定正確后膠回收純化。利用T4DNA連接酶對酶切產(chǎn)物進行16℃過夜連接，連接后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)雙酶切及測序篩選出陽性克隆，命名為pET24a-S1-CTD。

1.4 重組蛋白S1-CTD的表達鑒定及純化將重組質(zhì)粒pET24a-S1-CTD轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，于37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用IPTG誘導4～5 h，同時設(shè)置pET24a(+)空載對照組。8 000 r/min 離心10 min收集菌體，加入適量 PBS 重懸，超聲破碎菌體后，收集上清及沉淀并進行 SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白S1-CTD的表達。確定目的蛋白表達后利用Ni柱純化，以1∶500稀釋的PDCoV陽性血清為一抗，1∶5 000稀釋的山羊抗豬IgA-HRP為二抗進行Western blot鑒定；最后，利用試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，分裝后-80℃保存。

1.5 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化采用方陣滴定法分別對重組蛋白S1-CTD包被質(zhì)量濃度(32，16，8，4，2，1 mg/L)；包被條件(37℃ 2 h、37℃ 1 h及4℃過夜)；封閉液(1%BSA、5%脫脂乳和百迪泰酶標抗體穩(wěn)定劑)；封閉條件(37℃ 30 min，37℃ 1 h和37℃ 2 h)；血清稀釋度(1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320)；血清孵育時間(20，40，60 min)；酶標二抗稀釋度(1∶2 500，1∶5 000，1∶10 000，1∶20 000)；酶標二抗孵育時間(15，30，45，60 min)和底物顯色時間(5，10，15，20 min)進行優(yōu)化。按常規(guī) ELISA 方法操作，測定記錄D450 nm值，陽性血清與陰性血清的D450 nm比值(P/N)最大時，確定為該反應(yīng)的最佳條件。

1.6 臨界值的確定確定檢測條件后，檢測已知狀態(tài)的血清樣品，根據(jù)各樣品和陰、陽性對照的D450 nm值，計算樣品S/P值[S/P=(樣品D450 nm-陰性對照D450 nm)/(陽性對照D450 nm-陰性對照D450 nm)]。使用MedCalC軟件繪制血清檢測特征曲線(receiver operating characteristic，ROC)，對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行圖像化分析，選擇正確率較高的臨界值確定為該方法的臨床檢測臨界值。

1.7 特異性試驗使用優(yōu)化好的ELISA方法，檢測PEDV、PKV、FMDV和CSFV的標準陽性血清，并設(shè)立PDCoV陰陽性血清對照，每份樣品設(shè)3孔重復。利用酶標儀檢測D450 nm值，依據(jù)陰陽臨界值，判斷該方法與其他豬常見病毒病的病原有無交叉反應(yīng)。

1.8 重復性試驗選取5份PDCoV陽性樣品，分別在3塊同一批次包被的抗原板上和3塊不同批次包被的抗原板上檢測，計算批內(nèi)和批間變異系數(shù)，評價該方法的重復性。

1.9 敏感性試驗使用血清稀釋液對4份PDCoV陽性血清進行倍比稀釋，利用建立好的間接ELISA方法進行檢測，并設(shè)陰陽性血清對照，測定D450 nm值，計算出S/P值，分析該方法的敏感性。

1.10 間接ELISA檢測方法的初步應(yīng)用應(yīng)用本研究建立的檢測血清中PDCoV特異IgA抗體的間接ELISA方法，對本實驗室保存的60份陽性血清和40份陰性血清進行檢測，并設(shè)陰陽性血清對照，測定D450 nm值，計算出S/P值，以驗證間接ELISA方法的檢測結(jié)果是否可靠。

2 結(jié)果

2.1S1-CTD基因原核表達載體的鑒定通過PCR擴增S1-CTD基因，得到與預(yù)期大小相符的目的條帶，為422 bp(圖1)。使用T4DNA連接酶將目的基因與載體連接后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶(NheⅠ、XhoⅠ)雙酶切鑒定為陽性(圖2)，測序結(jié)果比對正確，說明原核表達載體構(gòu)建成功。

M.DNA 分子質(zhì)量標準；1.PDCoV S1-CTD基因；2.pET24a載體

M.DNA 分子質(zhì)量標準；1～3.重組質(zhì)粒pET24a-S1-CTD雙酶切產(chǎn)物

2.2 重組蛋白S1-CTD的表達鑒定及純化將pET24a-S1-CTD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG 37℃誘導5 h后，SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn)S1-CTD蛋白以包涵體形式表達，約19 kDa。對菌液超聲處理，8 mol/L Urea溶解包涵體，使用Ni柱純化，得到較純的目的蛋白(圖3)，質(zhì)量濃度為0.39 g/L。Western blot結(jié)果顯示S1-CTD蛋白能與PDCoV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖4)。

A.S1-CTD重組蛋白誘導表達；B.S1-CTD重組蛋白的純化。M.蛋白分子質(zhì)量標準；A1.誘導的pET24a-S1-CTD；A2.未誘導的pET24a-S1-CTD；A3.誘導的pET24a(+)空載體；A4.誘導的pET24a-S1-CTD上清；A5.誘導的pET24a-S1-CTD沉淀；A6.誘導的pET24a(+)空載上清；A7.誘導的pET24a(+)空載沉淀；B1.蛋白純化；B2.蛋白透析

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.PDCoV陽性血清;2.PDCoV陰性血清;←.主要抗原成分，含有二硫鍵結(jié)構(gòu)的蛋白；?.透析不徹底，不含二硫鍵結(jié)構(gòu)的蛋白

2.3 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化通過用方陣滴定法優(yōu)化，得到該ELISA方法的最優(yōu)反應(yīng)條件。結(jié)果顯示(表1，2，3)，抗原包被最佳質(zhì)量濃度為8 mg/L，血清最佳稀釋度為1∶10；最佳包被條件為37℃ 1 h；最適封閉液為百迪泰酶標抗體穩(wěn)定劑；最佳封閉條件為37℃ 1 h；血清最佳反應(yīng)時間為37℃ 40 min；酶標抗體最佳稀釋度為1∶5 000，最佳反應(yīng)時間為37℃ 45 min；TMB底物溶液最佳顯色時間為37℃ 10 min。

表1 抗原包被質(zhì)量濃度及血清稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

2.4 臨界值的確定確定間接ELISA反應(yīng)條件之后，用該方法檢測PDCoV 24份陰性血清和24份陽性血清，測定每份樣品D450 nm值，計算S/P值。統(tǒng)計數(shù)據(jù)，并繪制ROC曲線進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，當S/P≥ 0.489時為100%陽性，S/P<0.489時為100%陰性(圖5)。

A.血清檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計；B.血清檢測ROC曲線確定臨界值

2.5 特異性試驗取PEDV、PKV、FMDV及CSFV等4種常見豬病毒病的標準陽性血清，用本研究建立的間接ELISA進行特異性檢測，每份血清設(shè)3孔重復。結(jié)果顯示，4種標準陽性血清S/P值均小于0.489(圖6)，說明本研究建立的PDCoV間接ELISA抗體檢測方法均具有良好的特異性。

表2 包被條件、封閉液、封閉時間及血清孵育時間的優(yōu)化

表3 酶標二抗稀釋度、酶標二抗孵育時間及底物反應(yīng)時間的優(yōu)化

圖6 特異性試驗結(jié)果

2.6 重復性試驗選取5份陽性血清，使用建立的方法分別在同一批包被的檢測板上和不同批次包被的檢測板上進行3次重復檢測。結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)為2.09%～3.24%，批間變異系數(shù)為3.53%～6.10%(表4)。重復檢測變異系數(shù)均低于10%，說明該方法具有良好的重復性。

表4 重復性試驗

2.7 敏感性試驗選取4份PDCoV陽性血清，用血清稀釋液從1∶10開始進行倍比稀釋，利用建立好的間接ELISA方法進行檢測，分析此方法的敏感性。結(jié)果顯示，在血清1∶40稀釋時，4份血清全為陽性；1∶80稀釋時，4份血清全為陰性(圖7)。結(jié)果表明，該方法具有良好的敏感性。

圖7 敏感性試驗結(jié)果

2.8 間接ELISA檢測方法的初步應(yīng)用應(yīng)用本研究建立的檢測血清中PDCoV特異IgA抗體的間接ELISA方法，對本實驗室保存的60份陽性血清和40份陰性血清進行檢測，測定D450 nm值，計算S/P值。結(jié)果顯示，60份陽性血清檢測結(jié)果均為陽性，符合率為100%(60/60)，40份陰性血清中，38份檢測為陰性，2份為陽性，符合率為95%(38/40),總符合率為98%。結(jié)果表明，本試驗建立的間接ELISA方法的檢測結(jié)果準確、可靠，具有臨床應(yīng)用價值。

3 討論

PDCoV是一種新發(fā)現(xiàn)的豬腸道病毒，具有傳播速度快、病死率高的特點，尤其新生仔豬病死率高達80%，如不能得到及時有效的控制，會對養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。由于PDCoV與PEDV、TGEV等其他豬腸道病毒存在交叉感染，引起的臨床癥狀也極其相似，因此對該病的診斷主要依靠實驗室檢測[14]。間接ELISA檢測方法具有靈敏度高、特異性強、簡單快速等優(yōu)點，被廣泛用于臨床樣品檢查和血清流行病學調(diào)查。

有研究表明，仔豬在感染PDCoV后 14 d，在血清中能夠同時檢測到特異性抗體IgG和IgA，此后特異性抗體滴度逐漸增加并保持較高水平，直至豬從臨床疾病完全恢復[25]。黏膜免疫在病毒性腹瀉的免疫機制中起著關(guān)鍵的作用，黏膜處分泌的SIgA抗體能有效阻止病原體的入侵，是預(yù)防仔豬腸道傳染病的有效途徑[26]。目前,國內(nèi)很多學者基于M、N蛋白建立了檢測特異IgG抗體的間接ELISA方法[27-30]。但是，MA等[31]發(fā)現(xiàn)PEDV和PDCoV N蛋白上保守或相似的表位可能導致2種病毒的抗原產(chǎn)生雙向交叉反應(yīng)；GIMENEZ-LIROLA等[32]用以PEDV M蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法對PDCoV陽性血清進行抗體檢測時，出現(xiàn)了陽性結(jié)果，推測兩者之間可能存在共同的抗原表位；因此，M、N蛋白并不是建立血清學檢測方法的最佳抗原。PDCoV S蛋白的S1區(qū)域含有多個誘導機體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原受體結(jié)構(gòu)域，是制備抗體檢測ELISA試劑盒良好的候選蛋白。THACHIL等[33]開發(fā)了基于PDCoV S1蛋白的抗IgG間接ELISA試劑盒，是全世界首個檢測PDCoV的ELISA方法。LU等[34]以HEK-293T細胞表達的PDCoV S1蛋白作為包被抗原建立了檢測母乳中特異性IgA抗體的間接ELISA方法，批內(nèi)、批間變異系數(shù)為3.12%～8.47%和1.81%～14.26%；與其相比，本試驗建立的檢測血清中特異性IgA抗體的間接ELISA方法，批內(nèi)、批間變異系數(shù)為2.09%～3.24%和3.53%～6.10%，具有更好的重復性。王經(jīng)緯等[35]以昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的S1蛋白為包被抗原建立了ELISA檢測方法，但真核表達成本高、純化困難、周期長，不適于開發(fā)試劑盒。據(jù)報道，S蛋白基因在冠狀病毒成員中具有高度的變異性，可能導致基于S蛋白建立的ELISA方法的重復性和敏感性降低[36]。瞿歡等[37]利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達S1-CTD基因(832～1 848 bp)并建立了檢測IgG抗體的間接ELISA方法，其截短的S1-CTD基因包含部分S2區(qū)域，而本研究截取了S1-CTD抗原表位的核心區(qū)(877～1 299 bp)，能夠有效地減少S基因的變異點，提高間接ELISA方法的特異性和重復性；另外瞿歡等[37]建立的 PDCoV ELISA檢測方法是用來檢測血清中特異性IgG抗體的，而本研究建立的是對PDCoV防制更具有臨床實踐意義的IgA抗體ELISA檢測方法。

本試驗選取的S1-CTD基因序列中含有7個半胱氨酸殘基，在天然的蛋白結(jié)構(gòu)中可形成3對分子內(nèi)二硫鍵；由于研究選擇原核表達系統(tǒng)表達該目的蛋白，且以包涵體形式表達，因此表達的蛋白在未透析前不存在二硫鍵結(jié)構(gòu)。為了使其更接近天然蛋白結(jié)構(gòu)，在透析液中加入了氧化還原對(還原性谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽)，使其形成二硫鍵結(jié)構(gòu)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，透析后蛋白相對分子質(zhì)量稍大于透析前蛋白相對分子質(zhì)量，證明本研究中透析后的蛋白存在分子內(nèi)二硫鍵，更接近于天然蛋白結(jié)構(gòu)。在Western blot鑒定中，樣品選用透析后的重組蛋白S1-CTD，由于透析可能存在不徹底，因此圖中顯示為2條帶，稍大的為主要抗原成分，存在二硫鍵結(jié)構(gòu)的蛋白，稍小的為不存在二硫鍵結(jié)構(gòu)的蛋白(或存在部分二硫鍵)。

綜上，本試驗成功建立了檢測血清中PDCoV特異性IgA抗體的間接ELISA方法，通過反應(yīng)條件優(yōu)化，確定抗原最佳包被質(zhì)量濃度為8 mg/L、37℃包被 1 h；最佳封閉條件為百迪泰酶標抗體穩(wěn)定劑37℃封閉 1 h；血清最佳反應(yīng)條件為1∶10稀釋，37℃孵育 40 min；酶標抗體最佳反應(yīng)條件為1∶5 000 稀釋，37℃ 孵育45 min；TMB底物溶液最佳顯色時間為37℃ 10 min。結(jié)果表明，該方法檢測速度快，具有良好的特異性、重復性和敏感性，為臨床上PDCoV的診斷、疫苗免疫水平的監(jiān)測及研究提供了新的技術(shù)方法，為進一步開發(fā)臨床檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。