曾 偉，牛永東，張俏忻

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 汕頭 515041）

肝細(xì)胞癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大常見(jiàn)原因，造成了沉重的疾病負(fù)擔(dān)[1]。法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）在機(jī)體內(nèi)參與膽汁酸合成、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)，并能夠調(diào)節(jié)重要的靶基因[2]。研究推測(cè)其與原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，還可能在肝癌細(xì)胞中信號(hào)通路異常表達(dá)方面發(fā)揮著不可或缺的作用[3]。小異二聚體伴侶（small heterodimer partner，SHP）在許多代謝通路中起調(diào)節(jié)作用；膽汁酸鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）和鈉離子—?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na+-taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）影響肝細(xì)胞內(nèi)外的膽汁酸平衡；膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1） 和膽固醇12α羥化酶（sterol-12α-hydroxylase，CYP8B1）參與鵝去氧膽酸和膽酸的合成。鵝去氧膽酸為FXR最強(qiáng)有力的配體。肝細(xì)胞癌患者、肝硬化患者和健康人血漿中的鵝去氧膽酸水平存在明顯差異[4]，血漿中的鵝去氧膽酸變化水平可作為診斷鑒別肝硬化和肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物[5]。姜黃素可以有效抑制多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，且無(wú)明顯毒副作用，為潛在的抗肝細(xì)胞癌治療藥物[6]。本研究用鵝去氧膽酸處理HepG2細(xì)胞，考察其對(duì)FXR、BSEP、SHP、CYP7A1、CYP8B1、NTCP以 及β-catenin等膽汁酸靶基因mRNA的影響，并觀察鵝去氧膽酸和姜黃素對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的毒性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和藥物配制MTT、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，胰酶、結(jié)晶紫、4%的多聚甲醛購(gòu)于上海吉至生化科技有限公司。鵝去氧膽酸購(gòu)于美國(guó)MedChemExpress公司，純度≥98.0%，使用DMSO配制成15 mmol/L儲(chǔ)備液，采用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋至終濃度分別為1、3.3、10、20、30 μmol/L的藥液；姜黃素購(gòu)于美國(guó)MedChemExpress公司，純度≥98.0%，使用DMSO配制成30 mmol/L儲(chǔ)備液，采用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋至終濃度分別為5、15、30、45、60 μmol/L的藥液。

1.1.2 肝癌細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞均來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，分別由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院羅文鴻和牛永東課題組凍存保種。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，先將3 mL DMEM高糖完全培養(yǎng)基加入15 mL的無(wú)菌離心管。從-80℃冰箱內(nèi)取出凍存的肝癌細(xì)胞株，在37℃的恒溫水浴箱搖晃至完全溶解，隨后將細(xì)胞懸液移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用DMEM高糖完全培養(yǎng)基吹打混勻后，移入培養(yǎng)皿，在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，傳代，留樣凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定mRNA的表達(dá)水平取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，接種于6孔板并按濃度梯度加入鵝去氧膽酸，設(shè)置對(duì)照組。用Trizol法提取RNA，測(cè)定RNA質(zhì)量并調(diào)整RNA濃度，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。使用ABI QS5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔），反應(yīng)條件為95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，循 環(huán)40次；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s；4℃保存。采用2-ΔΔCT相對(duì)定量法比較各濃度藥物實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組mRNA的表達(dá)差異。引物序列見(jiàn)表1，內(nèi)參為cyclin。

表1 基因及引物序列

1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率將細(xì)胞接種至96孔板（2×103個(gè)/孔），在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過(guò)夜至細(xì)胞完全貼壁，吸棄培養(yǎng)基，設(shè)置空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（每組5個(gè)復(fù)孔），按濃度梯度加入配制好的藥液，放入培養(yǎng)箱，分別孵育24、48、72 h后取出，按20 μL/孔加入0.5%MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔中液體，按150 μL/孔加入DMSO，低速振蕩10 min后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處測(cè)量各孔的OD值。細(xì)胞存活率=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100%。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)將HepG2細(xì)胞均勻接種至6孔板（200個(gè)/孔），孵育過(guò)夜待細(xì)胞完全貼壁，吸棄培養(yǎng)基，分別使用含0.2%DMSO完全培養(yǎng)基（對(duì)照組）、15 μmol/L姜黃素、10 μmol/L鵝去氧膽酸、15 μmol/L姜黃素+10 μmol/L鵝去氧膽酸處理48 h后，更換新鮮培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)10 d。用4%的多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色，計(jì)算克隆成團(tuán)的細(xì)胞群。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。P≤0.05表示差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置至少3個(gè)平行樣本，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果

2.1 鵝去氧膽酸對(duì)HepG2細(xì)胞膽汁酸靶基因的mRNA表達(dá)影響

隨著鵝去氧膽酸濃度的提高，BSEP和SHP基因的mRNA表達(dá)逐步升高，而CYP7A1、CYP8B1、NTCP和β-catenin基因的mRNA則降低（P值均≤0.05），然而FXR基因mRNA表達(dá)量在不同藥物濃度的影響下無(wú)明顯差異變化（P＞0.05）。鵝去氧膽酸可能通過(guò)激活核受體FXR而調(diào)節(jié)關(guān)聯(lián)基因BSEP、SHP、CYP7A1、CYP8B1、NTCP和β-catenin的表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1 鵝去氧膽酸對(duì)HepG2細(xì)胞膽汁酸靶基因的mRNA表達(dá)影響

2.2 姜黃素和鵝去氧膽酸對(duì)肝癌細(xì)胞存活率的影響

按濃度從低到高分別單獨(dú)使用姜黃素和鵝去氧膽酸處理HepG2細(xì)胞24、48、72 h，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。姜黃素組和鵝去氧膽酸組細(xì)胞存活率都隨劑量的加大和時(shí)間的推移有明顯的下降（P≤0.05）。提示姜黃素可以抑制細(xì)胞HepG2增殖；鵝去氧膽酸激活FXR后同樣抑制了HepG2細(xì)胞的增殖。采用10 μmol/L的鵝去氧膽酸激活細(xì)胞FXR后再用各濃度姜黃素處理HepG2細(xì)胞，細(xì)胞存活率均較兩者單獨(dú)使用更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 姜黃素和鵝去氧膽酸對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

姜黃素組和鵝去氧膽酸組與對(duì)照組比較都隨劑量的加大和時(shí)間的推移有明顯的下降（P≤0.05），提示姜黃素可以抑制SMMC-7721增殖，鵝去氧膽酸激活FXR后同樣抑制了SMMC-7721細(xì)胞的增殖。采用10 μmol/L的鵝去氧膽酸激活細(xì)胞FXR后再用各濃度姜黃素處理SMMC-7721細(xì)胞，細(xì)胞存活率均較兩者單獨(dú)使用更低（P≤0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 姜黃素和鵝去氧膽酸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞存活率的影響

2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

單獨(dú)使用10 μmol/L的鵝去氧膽酸、15 μmol/L的姜黃素處理肝癌HepG2細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，其克隆形成率分別為（46.4±2.3）%、（53.2±1.9）%，表明鵝去氧膽酸和姜黃素對(duì)HepG2增殖均有一定程度的抑制作用。當(dāng)鵝去氧膽酸和姜黃素聯(lián)用后，其克隆形成率降至（10.2±1.6）%，提示鵝去氧膽酸和姜黃素聯(lián)用對(duì)抑制HepG2的增殖有疊加效應(yīng)。見(jiàn)圖4。

圖4 鵝去氧膽酸和姜黃素處理后HepG2細(xì)胞的克隆形成結(jié)果

3 討論

肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展是受多基因和多因素調(diào)控的過(guò)程。FXR在肝臟、腎臟、腸道和血管內(nèi)皮等器官組織中高水平表達(dá)，可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)FXR有顯著的抗腫瘤作用[7]。膽汁酸是膽固醇代謝的終產(chǎn)物，如發(fā)生異常導(dǎo)致水平升高，除產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用外，還有可能活化特定的膽汁酸受體，影響肝細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展[8]。鵝去氧膽酸是FXR的高效內(nèi)源性配體，有很高的激動(dòng)活性，F(xiàn)XR通過(guò)激活膽汁酸代謝基因從而直接或間接調(diào)控這種基因的表達(dá)。膽汁酸的合成與代謝受機(jī)體內(nèi)多種反饋機(jī)制調(diào)節(jié)，膽汁酸的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)對(duì)機(jī)體至關(guān)重要[9]。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)鵝去氧膽酸可能通過(guò)激活HepG2肝癌細(xì)胞中的FXR后，上調(diào)膽汁酸代謝的靶基因SHP和BSEP的表達(dá)，使影響膽汁酸合成的CYP7A1和CYP8B1的mRNA表達(dá)水平降低，并抑制NTCP和β-catenin的mRNA表達(dá)。此外，肝細(xì)胞內(nèi)鵝去氧膽酸水平上升也可能引起一系列反饋調(diào)節(jié)。機(jī)體內(nèi)參與膽汁酸代謝的靶基因較多，部分相關(guān)靶基因仍有待發(fā)現(xiàn)，具體通路機(jī)制也有待進(jìn)一步探討。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有重要的作用[10]。有國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)肝癌組織中β-catenin的表達(dá)最高，而在正常肝組織卻最低。特異性對(duì)β-catenin進(jìn)行干擾，使其表達(dá)降低，可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[11]。FXR還可以代償性促進(jìn)肝再生，敲除FXR基因的小鼠會(huì)發(fā)生肝細(xì)胞癌[12]。本研究提示鵝去氧膽酸激活FXR以調(diào)控各路膽汁酸關(guān)聯(lián)基因，可能成為預(yù)防治療肝細(xì)胞癌的靶點(diǎn)，并可能與下調(diào)β-catenin基因的表達(dá)有關(guān)。近年來(lái)對(duì)化療藥物抗腫瘤作用減毒增效的探求，使姜黃素的研究成為一個(gè)重要的研究領(lǐng)域[13]。但姜黃素的抗癌作用機(jī)制復(fù)雜，姜黃素對(duì)各種癌細(xì)胞的敏感程度不同，抑制能力不同，抑制癌細(xì)胞的作用機(jī)制也可能不同[14-15]。

本研究通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)鵝去氧膽酸和姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721的毒性作用，并通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證鵝去氧膽酸和姜黃素對(duì)HepG-2和SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，姜黃素和鵝去氧膽酸對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721均有細(xì)胞毒性。兩者均能呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的增殖，細(xì)胞的存活率隨藥物濃度加大和用藥時(shí)間的增加而下降，且聯(lián)用的效果加強(qiáng)。提示鵝去氧膽酸聯(lián)合姜黃素有抗肝細(xì)胞癌的應(yīng)用前景。綜上所述，鵝去氧膽酸對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞毒性與膽汁酸代謝有關(guān)，鵝去氧膽酸聯(lián)合姜黃素能更好地抑制肝癌細(xì)胞增殖。