岳炳南 孫嬌 李曉璐 周子?jì)?劉鑫 劉清國(guó)

原發(fā)性高血壓是一種常見(jiàn)的慢性疾病,導(dǎo)致了約62%的中風(fēng)和49%的心臟疾病發(fā)作[1]。 目前,該疾病的主要治療手段為口服藥物,而電針降壓則具有副作用少、綠色高效的優(yōu)勢(shì)。 本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)電針降壓機(jī)制進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)探究,研究發(fā)現(xiàn)針刺太沖穴可以通過(guò)提高不同靶腦區(qū)的葡萄糖代謝水平發(fā)揮其降壓的中樞效應(yīng),而下丘腦室旁核在激活的腦區(qū)中表現(xiàn)十分活躍[2],課題組還驗(yàn)證了電針可降低血管緊張素II 及炎癥因子的表達(dá),延緩高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展[3],除此之外,電針還可以通過(guò)調(diào)節(jié)非編 碼 RNA ( 如 microRNA) 降 低 血 壓[4-5], 而microRNA 則通過(guò)參與轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控,作用于下游受體蛋白,進(jìn)而影響心血管系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞的基本功能[6-7]。 基于以上,課題組使用基因檢測(cè)和分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)驗(yàn)證電針對(duì)miRNA-9 的影響,通過(guò)miRNA-9 對(duì)高血壓相關(guān)的炎癥因子白介素-6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)、 血 管 緊 張 素 II ( angiotensinII,ANGII)、P2X7 受體(recombinant purinergic receptor P2X ligand gated ion channel 7, P2RX7),以及小膠質(zhì)細(xì)胞的影響來(lái)探討電針的降壓機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

本實(shí)驗(yàn)采用自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rat, SHR)為動(dòng)物模型,12 周齡雄性SHR和Wistar Kyoto 大鼠(SPF 級(jí),250 ~280 g)均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)為SYXK(京)2016-0006。 所有動(dòng)物單籠飼養(yǎng),溫度恒定在25 ~27℃,并給以12 小時(shí)的光照,自由進(jìn)食、進(jìn)水。 大鼠在組織提取前一天禁食禁水。 實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批,所有動(dòng)物手術(shù)均在10%水合氯醛麻醉的情況下嚴(yán)格進(jìn)行,以減少動(dòng)物痛苦。

實(shí)驗(yàn)共分為五組,將40 只SHR 大鼠隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組、miR9 抑制劑+電針組、電針組、模型組(每組10 只),10 只 WKY 大鼠作為空白組。 其中,miR9 抑制劑+電針組行雙極插管植入術(shù)后注射miRNA-9 拮抗劑,并給以?xún)芍茈娽樦委?假手術(shù)組予以注射相同劑量腦脊液,不電針但進(jìn)行抓取;電針組注射相同劑量腦脊液,進(jìn)行兩周電針治療;模型組、空白組均只進(jìn)行抓取。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

試劑:miRNA-9 抑制劑(MCE 公司,HY-10074A,10 μmol);TRIzol 試劑(Invitrogen,10296028),CDNA合成試劑盒(ABI-invitrogen,11752050)和SYBY-qPCR混合物(ABI-invitrogen,4472920);Pierce BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Servicebioc,G2026);P2RX7 受體抗體(abcam,ab109054);重組Anti-Iba1 抗體[EPR16588](abcam,ab178846)。

儀器:無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)試儀(BP-6),酶標(biāo)分析儀(Rayto RT-6100),化學(xué)發(fā)光儀(CLINX 6300),電泳儀(Servicebio,BT-2);熒光定量 PCR 儀(Applied biosystems USA StepOne Software) 凝膠成像儀(biorad,2500);冷凍切片機(jī)(Leica),免疫組化掃描儀(3DHISTECH KFT),顯微鏡(CIC,XSP-C204);一次性針灸針(0.16 mm×7 mm,中研泰和股份有限公司)。

1.3 下丘腦室旁核雙極插管植入術(shù)與腦室內(nèi)注射

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 7 天后,采用戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔麻醉注射,麻醉起效后,在大鼠腦立體定位圖譜和文獻(xiàn)研究的指導(dǎo)下,通過(guò)腦立體定位儀標(biāo)記室旁核的位置(前囟門(mén)后1.8 毫米,矢狀縫兩側(cè)0.9 毫米,顱頂下7.9 毫米),消毒后,在室旁核兩側(cè)進(jìn)行鉆孔操作,植入雙極插管后,將牙科水泥涂于傷口[8-9]。 為減輕動(dòng)物的痛苦,手術(shù)過(guò)程盡量輕柔,并使用電熱毯為大鼠保暖,術(shù)后5 天內(nèi)每日給以青霉素抗炎治療。 本實(shí)驗(yàn)共對(duì)20 只SHR進(jìn)行手術(shù),手術(shù)中大鼠死亡1 只,術(shù)后大鼠死亡3只,后續(xù)購(gòu)入5 只后對(duì)其中4 只進(jìn)行手術(shù),補(bǔ)充至缺失組。

注射過(guò)程:微量注射器的針頭與PE 管相連,在排氣后插入雙極插管的兩側(cè)。 每次單側(cè)的下丘腦室旁核給藥劑量為100 nL,注射持續(xù)約5 分鐘。 每隔12 小時(shí)注射一次,連續(xù)給藥14 天。

1.4 干預(yù)方法

行植入術(shù)5 天后,對(duì)電針組、microRNA-9 抑制劑+電針組進(jìn)行電針干預(yù),持續(xù)2 周。 干預(yù)方法如下:將消毒后的一次性針灸針(0.16 mm×7 mm)直刺大鼠雙側(cè)的曲池、太沖穴2 mm,均使用平補(bǔ)平瀉法。 得氣后連接電針儀,電流強(qiáng)度為1 mA,頻率2 Hz,留針20 分鐘后出針。 為減輕大鼠的恐懼、緩解SHR 大鼠的暴躁行為,我們?cè)谥委熯^(guò)程中使用不透明的襪子制作了一個(gè)小型的針灸室,在無(wú)電針治療的假手術(shù)組、模型組、空白組進(jìn)行抓取,并將動(dòng)物放入襪子20 分鐘。

1.5 取材及指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 取材 干預(yù)結(jié)束后1 天進(jìn)行下丘腦取材,大鼠在10%水合氯醛麻醉后開(kāi)胸,并使心臟暴露,使用0.9%的氯化鈉溶液以及4%的多聚甲醛灌注后,按照大鼠腦立體定位圖譜取出下丘腦,一部分常規(guī)脫水后,使用石蠟包埋,制作切片(厚10 μm),另一部分保存于-80℃冰箱待檢測(cè)蛋白。

1.5.2 血壓測(cè)量 所有大鼠用恒溫器預(yù)熱15 分鐘,使其溫度穩(wěn)定在36℃左右。 用無(wú)創(chuàng)血壓儀連續(xù)3 次測(cè)量大鼠在安靜和清醒狀態(tài)下的尾部壓力取平均值,以避免噪音和其他外部環(huán)境刺激對(duì)收縮壓的影響。 為減少誤差,在針灸前0 天和針灸后3、7、10、14 天的上午 8:00 ~12:00 測(cè)量收縮壓,整個(gè)采集過(guò)程盡量保持輕柔,避免刺激大鼠,以免引起血壓波動(dòng)。

1.5.3 RNA 提取與實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR) 劑按照制造商的說(shuō)明用TRIzol 試從下丘腦室旁核提取含有 miRNA 和 P2X7 受體的mRNA。 按照制造商的說(shuō)明書(shū)使用CDNA 合成試劑盒和SYBY-qPCR 混合物,內(nèi)源性對(duì)照(U6)作為內(nèi)部參考,使用熔解曲線(xiàn)估計(jì)擴(kuò)增帶的純度。 通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算 miRNA-9 和 P2X7 受體 mRNA 相對(duì)定量。

1.5.4 ELISA 使用Rayto RT-6100 以及相應(yīng)的ELISA 試劑盒檢測(cè)下丘腦勻漿的上清液和取自腹主動(dòng)脈血漿中 ANGII、IL-6 和 TNF-α 的濃度,詳細(xì)操作見(jiàn)于制造商的使用說(shuō)明。

1.5.5 Western blot 使用Pierce BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Servicebioc G2026)評(píng)估下丘腦室旁核中的P2X7 受體的蛋白質(zhì)濃度,根據(jù)試劑盒說(shuō)明,制作10%的聚丙烯凝膠后,將10% 的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳用于分離樣品,然后將其電子轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜(0.45 μm Servicebioc G6015)上,使用300 mA 恒流膜半小時(shí)。 一抗(P2X7 受體,β-actin)加入后,4℃孵育過(guò)夜,二抗室溫孵育90 分鐘后,使用 AlphaEase FC、Adobe 軟件分析 P2X7 受體蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.5.6 免疫組化和圖像分析 將下丘腦組織在4%多聚甲醛中浸泡24 小時(shí),用Leica 冷凍切片機(jī)將含有下丘腦室旁核的樣品切片,厚度為10 μm,后將切片依次浸泡在二甲苯、無(wú)水乙醇、85% 酒精、75%酒精、蒸餾水中,在微波爐中加熱至沸騰,再將組織切片放在修復(fù)盒中進(jìn)行10 分鐘抗原修復(fù),然后將切片浸泡在3%的過(guò)氧化氫溶液中,在室溫遮光環(huán)境下培養(yǎng)25 分鐘,用PBS 清洗后,在搖床上搖晃3 次(每次5 分鐘),用PAP 筆在組織周?chē)鷺?biāo)記,加入3%BSA(Solarbio A8020)覆蓋圈中的組織,室溫下密封30 分鐘。 在玻片上加入PBS,滴入按比例制備的一抗,將玻片放在4℃的盒中,孵育過(guò)夜。 加入免疫組化試劑盒中相應(yīng)種類(lèi)的二抗(HRP 標(biāo)記)覆蓋組織,室溫下孵育50 分鐘,DAB 顯色反應(yīng)后,用Harris 蘇木精(品諾飛生物技術(shù)有限公司)反染。 最后用顯微鏡和掃描儀進(jìn)行圖像采集(graph bar=20 μm),采用使用 Image J 軟件計(jì)算平均光密度(average density,AOD)來(lái)反應(yīng)各組小膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文所有數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 26.0 進(jìn)行分析,所有計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)均為正態(tài)分布、方差齊,并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,數(shù)據(jù)采用單因素方差(ANOVA)分析,兩兩比較采用 LSD 檢驗(yàn)。 線(xiàn)性檢驗(yàn)通過(guò)Pearson 相關(guān)分析進(jìn)行分析。 其中 PCR 數(shù)據(jù)通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)定量,免疫組化的平均光密度數(shù)據(jù)(AOD=總密度/區(qū)域面積)使用Image J 軟件計(jì)算。P<0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠收縮壓

在手術(shù)和電針治療前,假手術(shù)組、模型組、miRNA-9 抑制劑+電針組、電針組大鼠的收縮壓明顯高于空白組大鼠(P<0.01),且模型組的大鼠在實(shí)驗(yàn)中保持了相對(duì)穩(wěn)定的高血壓狀態(tài)。 第七天起,電針組大鼠同假手術(shù)組相比,收縮壓有了明顯下降(P<0.05),經(jīng)過(guò)14 天的治療,電針組與 miRNA-9抑制劑+電針組相比,收縮壓明顯更低(P<0.05)如表1。

表1 各組大鼠收縮壓變化情況比較(,mmhg)

表1 各組大鼠收縮壓變化情況比較(,mmhg)

注: 與空白組相比, aP<0.01;與假手術(shù)組相比, bP<0.05,cP<0.01;與miRNA-9 抑制劑+電針組相比, dP<0.05。

組別 鼠只 第0 天 第3 天 第7 天 第10 天 第14天模型組 5 167.0±3.39a 167.4±2.30a 169.0±2.91a 169.4±2.40a 171.6±2.07a 91 108.8±2.58假手術(shù)組 5 167.6±2.88a 168.4±2.41 169.4±3.04 170.0±4.18 172.4±2.30 miRNA-9 抑制劑+電針組 5 166.2±1.30a 164.4±1.67 162.8±0.84 162.2±0.83 161.4±2.07電針組 5 167.0±2.23a 166.2±1.30 163.8±1.48b 161.6±2.64c 158.0±1.58d空白組 5 110.4±3.20 111.0±2.00 111.4±3.50 109.4±3.

2.2 電針對(duì)SHR 下丘腦室旁核中miRNA-9 水平的影響

采用RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)電針治療后各組下丘腦室旁核miR-9 的水平。 與空白組大鼠相比,模型組miRNA-9 的水平較低(P<0.05)。 此外,與假手術(shù)組、miR9 抑制劑+電針組相比,電針組均明顯提高了miRNA-9 表達(dá)水平(P<0.01),見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠下丘腦室旁核miRNA-9 表達(dá)水平比較()

表2 各組大鼠下丘腦室旁核miRNA-9 表達(dá)水平比較()

注: 與空白組相比, aP<0.05;與假手術(shù)組相比, bP<0.01;與miRNA-9 抑制劑+電針組相比, cP<0.01。

水平模型組 5 0.80±0.36組別 鼠只 下丘腦室旁核miRNA-9 a 1.67±0.14假手術(shù)組 5 0.51±0.08 miRNA-9 抑制劑+電針組 5 0.48±0.10電針組 5 2.74±0.35bc空白組5

2.3 miRNA-9 對(duì) IL-6、TNF-α 和 ANGII 的影響

由于電針可以明顯提高microRNA-9 的水平,且microRNA-9 抑制劑減弱了電針降壓的療效,為進(jìn)一步探究其機(jī)制,課題組檢測(cè)了高血壓的下游指標(biāo)IL-6、TNF-α 和 ANGII 的水平。

2.3.1 各組大鼠血清及室旁核中IL-6 水平 與空白組相比,模型組中的IL-6 含量明顯較高(P<0.01);與假手術(shù)組相比,電針組明顯降低了血清及室旁核中IL-6 的含量(P<0.01);與miRNA-9 抑制劑+電針組相比,電針組IL-6 的含量明顯降低(P<0.01),見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清及室旁核中IL-6 表達(dá)水平比較(,pg/mL)

表3 各組大鼠血清及室旁核中IL-6 表達(dá)水平比較(,pg/mL)

注:與空白組相比, aP<0.01;與假手術(shù)組相比, bP<0.01;與miRNA-9 抑制劑+電針組相比, cP<0.01。

水平模型組 5 2050.51±50.04a 111.07±5.83組別 鼠只 室旁核IL-6 水平 血清IL-6 a 5 1206.75±57.63 60.12±3.37假手術(shù)組 5 2260.22±141.17 124.36±8.42 miRNA-9 抑制劑+電針組 5 1758.87±67.26 95.80±2.91電針組 5 1556.47±52.92bc 80.35±2.26bc空白組

2.3.2 各組大鼠血清及室旁核中TNF-α 水平與空白組相比,模型組中的TNF-α 含量明顯較高(P<0.01);與假手術(shù)組相比,電針組血清及室旁核中 TNF-α 的含量下降明顯(P<0.01);與miRNA-9 抑制劑+電針組相比,電針組 TNF-α 的含量明顯更低(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清及室旁核中TNF-α表達(dá)水平比較(,pg/mL)

表4 各組大鼠血清及室旁核中TNF-α表達(dá)水平比較(,pg/mL)

注: 與空白組相比, aP<0.01;與假手術(shù)組相比, bP<0.01;與miRNA-9 抑制劑+電針組相比, cP<0.05。

血清TNF-α組別 鼠只 室旁核TNF-α 水平 水平模型組 5 2050.51±50.04a 188.75±9.91a假手術(shù)組 5 1678.42±68.81 198.98±3.50 miRNA-9 抑制劑+電針組 5 1466.17±57.16 163.03±13.53電針組 5 1338.29±45.34bc 150.20±8.63bc空白組5 1064.33±59.26 110.93±5.65

2.3.3 各組大鼠血清及室旁核中ANGII 水平 與空白組相比,模型組中的 ANGII 含量明顯較高(P<0.01);與假手術(shù)組相比,電針組明顯降低了ANGII 的含量(P<0.01);但電針組與miRNA-9 抑制劑+電針組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。 見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠血清及室旁核中ANGII表達(dá)水平比較(,pg/mL)

表5 各組大鼠血清及室旁核中ANGII表達(dá)水平比較(,pg/mL)

注: 與空白組相比, aP<0.01;與假手術(shù)組相比, bP<0.01。

水平組別 鼠只 室旁核ANGII 水平血清ANGII模型組 5 3.35±0.34a 20.25±0.94a假手術(shù)組 5 3.71±0.20 19.82±1.03 miRNA-9 抑制劑+電針組 5 2.17±0.16 14.57±1.23電針組 5 2.03±0.34b 14.36±0.76b空白組5 1.26±0.13 10.71±0.67

2.4 miRNA-9 對(duì)室旁核 P2X7 受體蛋白、P2X7 受體mRNA 水平的影響

在驗(yàn)證miRNA-9 的抗炎作用后,我們推測(cè)這可能與miRNA-9 抑制P2X7 受體和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān),為此進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.4.1 各組大鼠室旁核P2X7 受體蛋白表達(dá)及P2X7 受體 mRNA 水平 為驗(yàn)證 P2X7 受體和miRNA-9 在電針治療中的相關(guān)性,課題組檢測(cè)了各組大鼠下丘腦室旁核中P2X7 受體mRNA 和蛋白表達(dá)水平。 與空白組大鼠相比,模型組 P2X7 受體mRNA 水平明顯升高(P<0.01);電針治療后,mRNA 水平明顯低于假手術(shù)組(P<0.01);與miRNA-9 抑制劑組相比,電針組的mRNA 水平也明顯較低(P<0.01)。

此外,與空白組大鼠相比,模型組P2X7 受體蛋白水平明顯升高(P<0.01);電針組蛋白含量明顯低于假手術(shù)組(P<0.01);與miRNA-9 抑制劑+電針組相比,電針組蛋白含量較低(P<0.05),電針治療降低了SHR 中P2X7 受體的表達(dá),但miRNA-9 抑制劑阻斷了這一效應(yīng),見(jiàn)表6、圖1。

表6 各組大鼠P2X7 受體蛋白mRNA、P2X7 受體蛋白表達(dá)結(jié)果()

表6 各組大鼠P2X7 受體蛋白mRNA、P2X7 受體蛋白表達(dá)結(jié)果()

注: 與空白組相比, aP<0.01;與假手術(shù)組相比, bP<0.01;與miRNA-9 抑制劑+電針組相比, cP<0.01;與miRNA-9 抑制劑+電針組相比, dP<0.05。

組別 鼠只大鼠P2X7受體蛋白相對(duì)表達(dá)量模型組 5 2.15±0.139a 0.77±0.08大鼠P2X7受體mRNA差異倍數(shù)a 5 0.65±0.07 0.40±0.05假手術(shù)組 5 1.93±0.119 1.01±0.02 miRNA-9 抑制劑+電針組 5 1.64±0.17 0.62±0.09電針組 5 1.15±0.16bc 0.49±0.03bd空白組

圖1 各組大鼠室旁核內(nèi)P2X7 受體蛋白表達(dá)情況

2.4.2 miRNA-9 和P2X7 受體線(xiàn)性關(guān)系分析 為評(píng)估大鼠miRNA-9 水平是否影響P2X7 受體在下丘腦室旁核的表達(dá),分析了兩者之間的線(xiàn)性關(guān)系。 結(jié)果顯示,在下丘腦室旁核中,miRNA-9 相對(duì)含量與P2X7 受體蛋白表達(dá)以及mRNA 水平之間存在線(xiàn)性關(guān)系(P<0.01),呈負(fù)相關(guān)。 見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠室旁核中miRNA-9 與P2X7 受體蛋白水平、mRNA 水平的Pearson 線(xiàn)性相關(guān)性分析(共計(jì)25 組數(shù)據(jù))

2.5 各組大鼠室旁核內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況

免疫組化結(jié)果顯示:在室旁核內(nèi),與空白組大鼠相比,模型組、假手術(shù)組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯較多,著色較深,表達(dá)明顯;相比于miRNA-9 抑制劑+電針組,電針組著色明顯較淺,小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)不明顯,miRNA-9 抑制劑明顯刺激了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。

此外,課題組進(jìn)一步通過(guò)計(jì)算AOD 來(lái)反映小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況。 與空白組大鼠相比,模型組AOD值明顯較高(P<0.01);與假手術(shù)組相比,電針組AOD 值明顯較低(P<0.01),與miRNA-9 抑制劑+電針組相比,電針組AOD 值同樣較低(P<0.01)。 見(jiàn)表7、圖3。

圖3 各組大鼠室旁核小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況(免疫組化,×40,標(biāo)尺:20 μm)

表7 各組大鼠室旁核小膠質(zhì)細(xì)胞AOD 水平比較()

表7 各組大鼠室旁核小膠質(zhì)細(xì)胞AOD 水平比較()

注: 與空白組相比, aP<0.01;與假手術(shù)組相比, bP<0.01;與miRNA-9 抑制劑+電針組相比, cP<0.01。

AOD模型組 3 0.24±0.03組別 鼠只a 0.14±0.02假手術(shù)組 3 0.23±0.02 miRNA-9 抑制劑+電針組 3 0.21±0.01電針組 3 0.16±0.01bc空白組3

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為高血壓病屬“頭痛”“眩暈”范疇,《素問(wèn)·至真要大論》云:“諸風(fēng)掉眩,皆屬于肝?！备哐獕翰〉牟∝?zé)臟腑在肝。 肝氣郁滯,氣郁化火,導(dǎo)致肝火上炎,在病理狀態(tài)下,肝陽(yáng)易亢化成風(fēng),風(fēng)陽(yáng)上擾清明之府,可導(dǎo)致眩暈。 太沖穴作為降壓主穴可以起到良好的降壓效果,是現(xiàn)代臨床及實(shí)驗(yàn)研究中治療高血壓疾病的首選穴位之一。 實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),電針太沖穴可以從腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、交感神經(jīng)興奮等多個(gè)方面實(shí)現(xiàn)降壓[10-11]。 曲池穴亦為降壓常用腧穴,針刺曲池穴可通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路及途徑調(diào)控血壓變化[12-13]。 針刺后對(duì)機(jī)體細(xì)胞因子、信號(hào)通路、神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)及其理化性質(zhì)的改變都極具研究?jī)r(jià)值。

microRNA 與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)[14]。 其中,miRNA-9 可以靶向調(diào)控多種受體,如PDGFR-beta、Toll 途徑等對(duì)心血管功能進(jìn)行調(diào)節(jié)[15-16],這表明miRNA-9 可能是高血壓潛在的生物標(biāo)志物。 本研究發(fā)現(xiàn),電針增加了miRNA-9 在SHR大鼠下丘腦室旁核中的表達(dá),進(jìn)而起到降低血壓的療效。 此外,miRNA-9 能夠促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、抑制神經(jīng)炎癥[17]。 課題組同樣發(fā)現(xiàn),室旁核內(nèi)miRNA-9 明顯緩解了SHR 的神經(jīng)炎癥,此過(guò)程可能與其抑制P2X7 受體的表達(dá)有關(guān)。 但發(fā)現(xiàn),在電針治療過(guò)程中,miRNA-9 并未影響血管緊張素II 的表達(dá),這值得后學(xué)者進(jìn)一步探究。 而 ANGII 是腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)的主要產(chǎn)物,通過(guò)影響炎性因子、交感神經(jīng)興奮性等方式破壞下丘腦室旁核的神經(jīng)平衡,導(dǎo)致高血壓的發(fā)生[18]。 電針對(duì)ANGII 過(guò)表達(dá)而導(dǎo)致的高血壓疾病有良好的治療效果[3],在本研究中,經(jīng)電針治療后,SHR 室旁核及血清中ANGII 及炎癥因子的表達(dá)受到明顯抑制。

P2X7 受體在免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá),是一種ATP離子通道,為多個(gè)microRNA 的靶點(diǎn)[19-20],該受體加速了血管緊張素II 的釋放及血管收縮,并導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[21-22],電針可以通過(guò)對(duì)P2X7 受體的調(diào)控,影響大鼠痛覺(jué)敏化、改善微環(huán)境炎癥反應(yīng)等等[23-24],課題組同樣發(fā)現(xiàn)電針治療后,SHR 大鼠室旁核內(nèi)P2X7 受體能夠靶向地被microRNA-9 調(diào)節(jié),但microRNA9 的抗炎作用是否完全與P2X7 受體的抑制相關(guān),仍需進(jìn)一步驗(yàn)證與討論。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞,基于對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用,電針可以改善小鼠的記憶能力、調(diào)節(jié)信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)等[25-26]。 研究顯示,電針抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,但在miRNA-9 抑制劑使用后,小膠質(zhì)細(xì)胞明顯更加活躍,體現(xiàn)了其抗炎作用,

總之,電針通過(guò)miRNA-9 抑制了P2X7 受體的表達(dá)及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,同時(shí)降低了室旁核及血漿中炎癥因子IL-6、TNF-α,但并未抑制ANGII 的釋放,這提示應(yīng)對(duì)其下游指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè),例如活性氧以及交感神經(jīng)的興奮性等。