吳 慧,劉 芳,張利偉,3,劉 磊,4,宋文成,3*,王宏志,3*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,安徽 合肥 230032；2.中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 安徽省醫(yī)學(xué)物理與技術(shù)重點實驗室,健康與醫(yī)學(xué)技術(shù)研究所，安徽 合肥 230031；3.中國科學(xué)院 合肥腫瘤醫(yī)院,安徽 合肥230031；4.安徽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與生命健康學(xué)院，安徽 合肥 230061)

甲狀腺未分化癌是一種罕見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，具有易轉(zhuǎn)移、發(fā)展迅速等特點，而且致死率高達(dá)50%以上[1].目前甲狀腺未分化癌的常規(guī)治療手段主要有手術(shù)、放療、化療和靶向治療等，但是無論哪種治療方式，患者預(yù)后并不良好[2-4]，因此亟須一種新型有效的甲狀腺未分化癌的治療方式.

CAP是氣體在電離狀態(tài)下產(chǎn)生的物質(zhì)，其主要成分包括紫外線、活性粒子、電子、離子等[5-6].因其具有可在大氣壓條件下產(chǎn)生、溫度接近于室溫等特點，故在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景.研究表明，CAP在傷口愈合、殺菌、口腔醫(yī)療及癌癥治療等方面都具有重要作用[7-10].自從2007年首次發(fā)現(xiàn)CAP具有促進黑色素瘤細(xì)胞凋亡的作用后，等離子體抗癌作用成為研究的熱點，目前已有研究報道CAP對于肺癌、宮頸癌、乳腺癌、肝癌、口腔癌等多種類型的癌癥具有良好的抑制作用[11-14].一定劑量的CAP處理除了能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以外，還可通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和細(xì)胞壞死發(fā)揮作用.然而CAP抑制癌細(xì)胞的具體分子機制尚未明確.

筆者將CAP應(yīng)用于抑制甲狀腺未分化癌CAL-62細(xì)胞生長的研究，并使用生物信息學(xué)手段揭示等離子體處理對CAL-62細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化情況，以探究等離子體抑制CAL-62細(xì)胞的分子機制，以期為CAP對甲狀腺未分化癌的治療提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人甲狀腺未分化癌細(xì)胞株(CAL-62)購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司.

1.2 實驗試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液購自澳大利亞Gibco；胎牛血清購自上海雙洳生物科技有限公司；胰蛋白酶細(xì)胞消化液、青霉素/鏈霉素(100×)購自生工生物工程股份有限公司；RIPA裂解液、硝酸纖維素膜、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購自碧云天公司；甲醇購自生工生物工程股份有限公司；Super SignalTMWest Pico PLUS化學(xué)發(fā)光底物購自Thermo公司；TRizol試劑盒購自Invitrogen公司；高純氦氣(99.999%)購自南京特種氣體廠股份有限公司.倒置顯微鏡購自明美光電技術(shù)公司；化學(xué)發(fā)光儀購自Tanon公司.

1.3 方 法

(1)細(xì)胞培養(yǎng).取對數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞CAL-62接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng).

(2)CAP處理.使用介質(zhì)阻擋放電等離子體裝置，裝置示意圖如圖1(a)所示.該裝置的反應(yīng)腔室內(nèi)有4對由圓形銅板構(gòu)成的高壓電極和接地電極(直徑分別為58 mm和62 mm)，電極外有1 mm厚的石英玻璃作為阻擋介質(zhì).工作氣體為氦氣(99.999%)，以2.67 L·min-1的流速由進氣口進入，多余的空氣可由出氣口排出，峰值電壓為6 kV.

細(xì)胞處理方式如圖1(b)所示，將6×105個細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后棄掉原培養(yǎng)基，加入5 mL新鮮的培養(yǎng)基，將孵育在培養(yǎng)基中的細(xì)胞放置到等離子體處理裝置反應(yīng)腔室中，通氦氣90 s后再接通電源產(chǎn)生等離子體作用于細(xì)胞.對照組不進行等離子體處理，處理組等離子體處理30 s.

(a)CAP處理裝置原理示意圖；(b)CAP處理CAL-62細(xì)胞方法流程圖.

(3)mRNA提取.細(xì)胞經(jīng)等離子體處理30 s后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，收集到離心管；按照TRizol試劑盒方法提取細(xì)胞中的總RNA，每次處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù).提取后的mRNA使用安捷倫2100生物分析儀評估m(xù)RNA的完整性.

(4)cDNA制備及測序.使用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，加入陽離子將mRNA隨機打斷；將隨機引物加入片段化的mRNA中進行DNA一鏈的合成，進一步用dUTP代替dTTP合成DNA二鏈；對擴增好的cDNA進行末端修復(fù)、加“A”和接頭連接，對連接產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)并檢測文庫質(zhì)量；將PCR產(chǎn)物變性為單鏈，進行環(huán)化得到最終的cDNA文庫，使用DNBSEQ平臺測序.

(5)RNA-seq分析.使用SOAPnuke軟件對測序所得的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，去除具有接頭污染、未知堿基含量大于5%、低質(zhì)量的Reads，獲得Clean Reads.然后將Clean Reads比對到參考序列，合格后進行基因定量分析、基于基因表達(dá)水平的各項分析(主成分、相關(guān)性、差異基因篩選等).設(shè)置|log2FC|≥1,q-value≤0.01(fold change, 簡稱FC，表示實驗組/對照組的基因表達(dá)豐度差異倍數(shù))，篩選出的樣品間差異表達(dá)基因674個，其中有287個上調(diào)基因和387個下調(diào)基因，分別對上調(diào)基因和下調(diào)基因進行KEGG pathway顯著性富集分析.根據(jù)KEGG pathway注釋分類，對差異基因進行功能分類，使用R軟件中的phyper函數(shù)進行富集分析，計算p-value，然后對p-value進行FDR校正得到q-value.根據(jù)GO分類，對差異基因進行功能分類，并使用R軟件中的phyper功能進行富集分析，計算p-value，然后對p-value進行FDR校正得到q-value.

(6)線粒體膜電位檢測.CAP處理4 h后，根據(jù)線粒體膜電位試劑盒(JC-1, Solarbio，北京，中國)說明，丟棄原培養(yǎng)基，然后用PBS洗滌細(xì)胞2次.隨后在每個培養(yǎng)皿中加入2 mL DMEM培養(yǎng)基，并在其中加入預(yù)先準(zhǔn)備好的JC-1染色工作液并充分混合.再將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中孵育20 min后棄去培養(yǎng)皿中液體，用預(yù)先準(zhǔn)備好的JC-1染色緩沖液洗滌2次，棄去.最后在每個培養(yǎng)皿中再次加入2 mL DMEM培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察并記錄熒光圖像.采用Image J軟件進行熒光定量分析.

(7)細(xì)胞遷移實驗.細(xì)胞遷移實驗在孔徑為8 μm的24孔Transwell小室(Costar, 華盛頓哥倫比亞特區(qū)，美國)中進行.先將CAP處理后孵育4 h的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液.然后對細(xì)胞懸液進行計數(shù)，使細(xì)胞數(shù)量約為1×105mL-1.在Transwell小室上室中加入200 μL不含胎牛血清的DMEM細(xì)胞懸液.在下室中添加500 μL含10% 胎牛血清的DMEM作為誘導(dǎo)劑，孵育約24 h后，用PBS洗滌細(xì)胞，再用4%多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色.然后用棉簽輕輕擦除未穿過上室膜的細(xì)胞，在低倍顯微鏡(100倍)下隨機選擇5個視野，觀察并記錄穿過上室膜的細(xì)胞數(shù)量.

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復(fù)3次，實驗結(jié)果由平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗檢測組間差異，p<0.05具有顯著性差異.* * *p<0.001, * *p<0.01, *p<0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 CAP抑制CAL-62細(xì)胞生長

為了探究CAP處理對CAL-62細(xì)胞生長的影響，將對照組和CAP處理30 s的細(xì)胞于倒置顯微鏡下拍攝圖片，分別記錄CAP處理后0，6，12 h時CAL-62細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果如圖2所示.圖2顯示，CAP處理12 h后，細(xì)胞的形狀發(fā)生皺縮，細(xì)胞收縮變圓.而CAP處理后0 h細(xì)胞形態(tài)變化并不明顯，處理6 h后細(xì)胞略有收縮，這說明CAP對細(xì)胞形態(tài)的影響是一個逐漸緩慢的過程，需要一定的作用時間.

圖2 CAP處理后CAL-62細(xì)胞形態(tài)變化

2.2 CAP處理后CAL-62細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組概況

設(shè)對照組和CAP處理組2組細(xì)胞，每組3個重復(fù)，測得6個轉(zhuǎn)錄組樣品.每個樣品平均產(chǎn)出6.73 GB數(shù)據(jù)，共檢測到16 861個基因.通過比對對照組和CAP處理組的CAL-62細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，共有674個基因差異表達(dá)(圖3)，其中287個基因上調(diào)表達(dá)，387個基因下調(diào)表達(dá)(|log2FC|≥1,q-value≤0.01).

圖3 CAP處理后細(xì)胞差異基因表達(dá)火山圖

2.3 CAP處理前后轉(zhuǎn)錄組差異基因KEGG富集分析

分別將上調(diào)的287個差異基因和下調(diào)的387個差異基因進行KEGG富集分析，并篩選出20條富集最顯著的通路，結(jié)果如圖4所示.

(a)CAP處理后上調(diào)基因的KEGG富集；(b)CAP處理后下調(diào)基因的KEGG富集.

圖4(a)顯示，上調(diào)基因主要富集在MAPK信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、抗原過程及呈遞等相關(guān)信號通路和癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)等中.其中，差異基因富集條目最多的通路是MAPK信號通路，說明CAP處理可以在一定程度上激活MAPK信號通路，從而進一步調(diào)節(jié)CAL-62細(xì)胞.圖4(b)顯示，下調(diào)基因主要集中在肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、Rap1信號通路、癌癥MicroRNAs、ErbB信號通路、FoxO信號通路、Notch信號通路等相關(guān)性信號通路中.

2.4 CAP處理前后轉(zhuǎn)錄組差異基因GO富集分析

同樣的，將上調(diào)基因和下調(diào)基因分開進行GO富集分析，并展示其中差異最顯著的20個條目，結(jié)果如圖5所示.

圖5(a)顯示，上調(diào)表達(dá)的差異基因的GO富集中差異基因主要富集的條目是免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡過程、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控和固有免疫反應(yīng).上調(diào)差異基因在細(xì)胞凋亡過程的富集說明CAP處理可以促進CAL-62細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生.圖5(b)顯示，下調(diào)表達(dá)的差異基因的GO富集中差異基因主要富集的條目是磷酸化(含蛋白質(zhì)磷酸化)、細(xì)胞對DNA損傷刺激的反應(yīng)和GTPase活性正調(diào)控.

(a)CAP處理后上調(diào)基因的GO富集；(b)CAP處理后下調(diào)基因的GO富集.

2.5 CAP處理后CAL-62細(xì)胞基因的差異表達(dá)

按照|log2FC|≥1,q-value≤0.01，對差異基因進行篩選，篩選出了674個差異顯著基因.分別對上調(diào)和下調(diào)的前20個差異基因制作其在對照組和CAP處理組的基因差異表達(dá)熱圖，如圖6所示.其中CAP處理后BIK，CDKN1C等基因顯著上調(diào)表達(dá)，TANC2，ESM1，CBL，DST，PLXNA2等基因顯著下調(diào)表達(dá).

(a)差異顯著的前20個上調(diào)基因；(b)差異顯著的前20個下調(diào)基因.

2.6 部分基因在腫瘤組織和癌旁組織的差異表達(dá)情況

接下來，為了探究顯著差異表達(dá)的部分基因在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)情況,筆者基于TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)信息對BIK，CDKN1C，TANC2，ESM1，CBL這5個基因在甲狀腺癌組織和正常組織之間的表達(dá)情況進行了分析展示，結(jié)果如圖7所示.

圖7 5個基因在甲狀腺癌中的表達(dá)水平

圖7顯示，BIK，CDKN1C，TANC2，ESM1，CBL基因在甲狀腺癌組織和正常組織之間的表達(dá)存在顯著差異，其中BIK和CDKN1C在甲狀腺癌組織中的表達(dá)明顯低于正常組；TANC2，ESM1和CBL在腫瘤中的表達(dá)明顯高于正常組.說明低水平的BIK和CDKN1C表達(dá)更有利于甲狀腺癌細(xì)胞的生存，而CAP處理導(dǎo)致的BIK和CDKN1C基因表達(dá)的上調(diào)，可以一定程度向正常組靠攏.同樣，CAP處理后TANC2，ESM1和CBL表達(dá)下調(diào)也能達(dá)到這樣的效果.

2.7 CAP處理CAL-62細(xì)胞引起基因差異表達(dá)驗證

與對照組相比，CAP處理組的基因表達(dá)水平發(fā)生了很多變化.轉(zhuǎn)錄組分析顯示APAF1，JNK等基因顯著上調(diào)；AKT1，AKT3，PIK3等基因顯著下調(diào).因此，選擇這些基因進行WB驗證，實驗結(jié)果如圖8所示：CAP處理組的JNK，APAF1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；AKT，PI3K的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，證明了轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的準(zhǔn)確性.

(a)CAP處理組和對照組差異基因表達(dá)WB驗證；(b)WB條帶量化統(tǒng)計.

2.8 CAP處理降低CAL-62細(xì)胞線粒體膜電位

線粒體膜電位下降是細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)志性事件.上述的結(jié)果表明CAP處理改變了CAL-62細(xì)胞的形態(tài)，進一步探究CAP處理對CAL-62細(xì)胞線粒體膜電位的影響.熒光定量分析結(jié)果如圖9所示，與對照組相比，CAP處理組的綠色/紅色熒光比值顯著增加.表明CAP處理降低了CAL-62細(xì)胞的線粒體膜電位，誘導(dǎo)了細(xì)胞的早期凋亡.

(a)細(xì)胞線粒體膜電位的熒光圖像；(b)熒光圖量化統(tǒng)計.

2.9 CAP處理對CAL-62細(xì)胞遷移的作用

用Transwell實驗探索CAP處理對CAL-62細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果如圖10所示，與對照組相比，CAP處理組的細(xì)胞遷移量顯著減少，幾乎沒有細(xì)胞穿過上室膜.表明CAP處理明顯抑制了CAL-62細(xì)胞的遷移.

(a)用Transwell法分析CAP處理后CAL-62細(xì)胞的遷移情況；(b)跨膜細(xì)胞數(shù)量量化分析.

3 討論與結(jié)論

雖然CAP的體外抗腫瘤作用被廣泛證實，但是關(guān)于CAP對甲狀腺癌抑制效果的報道較少.一項體外研究表明，CAP可以通過促進p-JNK，p-P38，caspase-3的表達(dá)引起甲狀腺未分化癌細(xì)胞HTH83，U-HTH 7和SW1763發(fā)生細(xì)胞凋亡[14].此外，大氣壓低溫等離子體對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株(BHP10-3和TPC1)也具有良好的抑制效果，等離子體可以通過調(diào)控FAK/Src復(fù)合體來抑制MMP-2/-9和uPA的活性，進一步抑制細(xì)胞的遷移和侵襲[15].

筆者使用未處理的CAL-62細(xì)胞作為對照組，CAP處理的CAL-62細(xì)胞作為處理組，進行了一系列實驗分析：

(1)使用未處理的CAL-62細(xì)胞作為對照組，CAP處理30 s的CAL-62細(xì)胞作為處理組，發(fā)現(xiàn)一定劑量的CAP處理后不久大部分細(xì)胞會經(jīng)歷形態(tài)收縮的變化過程，處理引起的細(xì)胞內(nèi)溶液泄漏可以進一步導(dǎo)致細(xì)胞收縮和細(xì)胞起泡[16-17].而且CAP處理還會顯著降低細(xì)胞的線粒體膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡.此外，細(xì)胞活力的下降是CAP殺傷癌細(xì)胞的重要表現(xiàn)之一，對于體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞或者3D腫瘤模型，等離子體都具有良好的抑制細(xì)胞增殖的效果[18-20].

(2)通過轉(zhuǎn)錄組分析檢測到的部分基因與癌癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān).BIK作為Bcl-2家族中的凋亡誘導(dǎo)蛋白，具有促進凋亡的作用，在非小細(xì)胞肺癌中抑制BIK的表達(dá)可以促進腫瘤的發(fā)生[21].CDKN1C基因是一種腫瘤抑制基因，在G1期起到調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進程的作用，研究報道CDKN1C的表達(dá)在雌激素受體陽性/HER 2陰性的乳腺癌以及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后中具有重要作用[22-23].因此BIK，CDKN1C等基因的上調(diào)表達(dá)可以在一定程度上促進細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞周期進程，從而發(fā)揮抑癌作用.ESM1與細(xì)胞的遷移密切相關(guān)，研究顯示，ESM1可以作為下游分子參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移[24]，而且沉默ESM1可以顯著降低肝細(xì)胞癌的遷移和侵襲[25].筆者的Transwell實驗結(jié)果也證明了CAP處理對CAL-62細(xì)胞遷移的抑制作用.此外，ESM1基因與腎癌患者的VEGFA表達(dá)呈現(xiàn)較強的相關(guān)性[26].CBL是一個原癌基因，可以作為許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)器發(fā)揮作用[27].CAP處理引起的CAL-62細(xì)胞內(nèi)ESM1，CBL等基因的表達(dá)水平的下調(diào)可以在一定程度上發(fā)揮抑制細(xì)胞遷移的作用.差異基因在某些信號通路的富集情況也能反應(yīng)CAP對CAL-62細(xì)胞的抑制作用.Rap1信號通路在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，是多條信號通路的分子開關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用.下調(diào)差異基因在Rap1信號通路的顯著富集說明CAP處理可以在一定程度上抑制Rap1信號通路.ErbB受體信號通過AKT，MAPK以及其他多種通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、分化、凋亡，ErbB作為惡性腫瘤的治療靶標(biāo)之一，CAP處理導(dǎo)致的下調(diào)可在一定程度上降低CAL-62細(xì)胞的惡性程度.

(3)從轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平探究了CAP對CAL-62細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)CAP處理可明顯造成CAL-62細(xì)胞基因的差異表達(dá)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明CAP處理后CAL-62細(xì)胞的基因表達(dá)發(fā)生明顯改變，共檢測到674個基因差異表達(dá)，其中287個基因上調(diào)表達(dá)，387個基因下調(diào)表達(dá).其中BIK，CDKN1C等基因顯著上調(diào)，TANC2，ESM1，CBL等基因顯著下調(diào).并且對差異基因進行了KEGG富集和GO分類，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平探究了CAP抑制甲狀腺未分化癌的分子機制，為CAP應(yīng)用于甲狀腺未分化癌的治療提供了一定的理論基礎(chǔ).