陳 晨 鄭潤泉 李宗玉 （中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第960醫(yī)院骨科，濟南 250031）

地塞米松（dexamethasone，DEX）等糖皮質(zhì)激素廣泛應(yīng)用于臨床抗炎、免疫調(diào)節(jié)等方面，但糖皮質(zhì)激素的長期使用可導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松等并發(fā)癥［1］。糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松是臨床常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松類型，其發(fā)病率僅次于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和老年學(xué)骨質(zhì)疏松［2］。研究表明，糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展的原因在于糖皮質(zhì)激素可抑制骨細胞形成，促使其凋亡［3］。目前，通過干預(yù)相關(guān)基因減少成骨細胞凋亡是研究的熱點。微小RNA（miRNA）是一類參與調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等生命過程的小分子非編碼RNA，在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［4-6］。研究顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中miR-218-5p 表達下調(diào)，上調(diào)miR-218-5p 可促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，緩解絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥［7］。但目前miR-218-5p 對糖皮質(zhì)激素引起的成骨細胞損傷的影響和機制仍不明確。Starbase 生物在線軟件預(yù)測顯示，錨蛋白重復(fù)域1（ANKRD1）可能是miR-218-5p的靶基因。ANKRD1 是錨定重復(fù)蛋白家族成員，參與調(diào)控細胞增殖和凋亡等過程［8-9］。有報道稱，ANKRD1 在骨質(zhì)疏松癥患者中表達升高，可能參與調(diào)節(jié)骨骼肌細胞分化［10］。本研究以人成骨細胞HFOB1.19 為研究對象，探究miR-218-5p 對地塞米松誘導(dǎo)的HFOB1.19 細胞凋亡和炎癥因子表達的影響，及其能否靶向調(diào)控ANKRD1 發(fā)揮作用，以期了解miR-218-5p/ANKRD1 軸對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展的影響，并為其治療提供分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人成骨細胞HFOB1.19 購自杭州仟諾生物科技有限公司；地塞米松購自美國Sigma公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青；α-MEM 培養(yǎng)基、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；LipofectamineTM2000 試劑盒、Trizol 試劑購自美國Invitrogen公司；miR-218-5p模擬物（mimics）、模擬對照序列（miR-NC）、亂序無意義陰性序列（si-NC）、ANKRD1 小干擾RNA（si-ANKRD1）、ANKRD1 過表達載體（pcDNA-ANKRD1）、空載體（pcDNA）、ANKRD1野生型質(zhì)粒（WT-ANKRD1）、突變型質(zhì)粒（MUTANKRD1）及PCR 引物購自上海生工生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；IL-6、IL-1β 和TNF-α 試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗人B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白（Bax）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇HFOB1.19細胞，用含10%FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基（常規(guī)培養(yǎng)基）培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的HFOB1.19 細胞以5.0×105個/孔接種于6 孔板，利用LipofectamineTM2000 試劑盒采用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-218-5p mimics、si-NC、si-ANKRD1，共轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimics 與pc-DNA-ANKRD1、miR-218-5p mimics 與pcDNA。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞備用。

1.2.2 細胞分組處理 未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后的HFOB1.19 細胞均以5.0×105個/孔接種于6 孔板。其中未轉(zhuǎn)染的HFOB1.19 細胞分為對照組和DEX組，對照組細胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，DEX組細胞用含10 μmol/L DEX 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h［11］。轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-218-5p mimics、si-NC、si-ANKRD1，共轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimics與pcDNA-ANKRD1、miR-218-5p mimics 與pcDNA 的細胞均用含10μmol/L DEX的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，并分別記為DEX+miR-NC 組、DEX+miR-218-5p 組、DEX+si-NC 組、DEX+si-ANKRD1 組、DEX+miR-218-5p+pcDNA-ANKRD1 組、DEX+miR-218-5p+pcDNA 組。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細胞及細胞培養(yǎng)上清液備用。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 RT-qPCR 檢測細胞中miR-218-5p 和ANKRD1 mRNA 表達 Trizol 試劑提取各組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，行PCR 擴增。擴增程序：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35個循環(huán)。miR-218-5p 正向引物：5'-GATGAAGGTTTCCCACCTTGTC-3'，反向引物：5'-GACTGGGAGA‐AGTGGGTCTG-3'；U6 正向引物：5'-GCGAGATAG‐TAGCGAAGCA-3'，反向引物：5'-CGACGACGCTTC‐GCGCTCG-3'；ANKRD1 正向引物：5'-GATCGAATTCCGTGATATGCT-3'，反向引物：5'-AAACATC‐CAGGTTTCCTCCA-3'；GAPDH 正向引物：5'-CG‐CAGCATACTTAATAAACCG-3'，反向引物：5'-GGT‐GGCGAGAGTCTAAG-3'。2?ΔΔCt法計算miR-218-5p相對于U6、ANKRD1 相對于GAPDH的表達水平。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將各組細胞用PBS溶液清洗2次，并調(diào)整細胞密度為1.0×106個/ml。取1.0 ml 細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。加500 μl 結(jié)合緩沖液，混懸細胞后，分別加10 μl Annexin V-FITC 和5μl PI，室溫避光孵育15 min 后，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 Western blot 檢測Bcl-2 和Bax 蛋白表達 RIPA 試劑提取各組細胞總蛋白，BCA 法測蛋白含量，行10%SDS-PAGE 電泳。電泳后，將分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂奶粉中封閉1 h。分別于Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）一抗中4 ℃孵育過夜。再于山羊抗兔二抗（1∶2 000）中37 ℃孵育1 h。加化學(xué)發(fā)光試劑避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6 ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-1β和TNF-α 水平 將收集的各組細胞培養(yǎng)上清液以3 500 r/min 離心5 min，保留上清。分別參照IL-6、IL-1β 和TNF-α ELISA 試劑盒說明書檢測其在上清中的水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?將HFOB1.19細胞以5.0×105個/孔接種于6 孔板，LipofectamineTM2000試劑盒采用脂質(zhì)體法分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ANKRD1與miR-NC 或miR-218-5p mimic、MUT-ANKRD1 與miR-NC 或miR-218-5p mimic。轉(zhuǎn)染6 h 后，更換培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，收集細胞并裂解，檢測熒光素酶活性，具體操作參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEX 對人成骨細胞中miR-218-5p 和ANKRD1表達的影響 與對照組相比，DEX 組成骨細胞中miR-218-5p 表達水平降低（P<0.05），ANKRD1 mRNA和蛋白表達水平升高（P<0.05）。見圖1。

圖1 miR-218-5p和ANKRD1在DEX誘導(dǎo)的成骨細胞中的表達Fig.1 Expressions of miR-218-5p and ANKRD1 in DEXinduced osteoblasts

2.2 過表達miR-218-5p對DEX 誘導(dǎo)的人成骨細胞損傷的影響 與對照組相比，DEX 組成骨細胞凋亡率和Bax 蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低，IL-6、IL-1β 和TNF-α 表達水平升高（P<0.05）。與DEX+miR-NC 組相比，DEX+miR-218-5p 組成骨細胞中miR-218-5p 表達升高，細胞凋亡率和Bax 蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，IL-6、IL-1β和TNF-α表達水平降低（P<0.05）。見圖2。

圖2 過表達miR-218-5p 對DEX 誘導(dǎo)的人成骨細胞凋亡及炎癥因子表達的影響Fig.2 Effect of overexpression of miR-218-5p on DEX-in?duced apoptosis and expressions of inflammatory factors in human osteoblasts

2.3 miR-218-5p靶向調(diào)控ANKRD1表達 Starbase生物在線軟件預(yù)測顯示，miR-218-5p 與ANKRD1 的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點，見圖3A。共轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimics與WT-ANKRD1的細胞熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-NC 與WT-ANKRD1 的細胞（0.39±0.02vs1.01±0.05，t=11.527，P<0.05），而共轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimics 與MUT-ANKRD1 的細胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miR-NC與MUT-ANKRD1的細胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（0.99±0.04vs1.02±0.05，t=0.369，P=0.731），提示miR-218-5p 可靶向結(jié)合ANKRD1，見圖3B。與轉(zhuǎn)染miR-NC 的細胞相比，轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimics 的細胞中ANKRD1 蛋白表達降低（0.45±0.02vs1.01±0.05，t=18.011，P<0.05，圖3C）。

圖3 miR-218-5p靶向調(diào)控ANKRD1表達Fig.3 miR-218-5p target regulated expression of ANKRD1

2.4 敲減ANKRD1對DEX 誘導(dǎo)的人成骨細胞損傷的影響 與DEX+si-NC 組相比，DEX+si-ANKRD1組成骨細胞中ANKRD1 蛋白表達降低，細胞凋亡率和Bax 蛋白表達降低，Bcl-2 蛋白表達升高，IL-6、IL-1β和TNF-α表達水平降低（P<0.05）。見圖4。

圖4 敲減ANKRD1 對DEX 誘導(dǎo)的人成骨細胞凋亡及炎癥因子表達的影響Fig.4 Effect of knockdown of ANKRD1 on DEX-induced apoptosis and expressions of inflammatory factors in human osteoblasts

2.5 過表達ANKRD1 逆轉(zhuǎn)過表達miR-218-5p 對DEX 誘導(dǎo)的人成骨細胞損傷的影響 與DEX+miR-218-5p+pcDNA 組相比，DEX+miR-218-5p+pcDNAANKRD1 組成骨細胞中ANKRD1 蛋白表達升高，細胞凋亡率和Bax 蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低，IL-6、IL-1β 和TNF-α 表達水平升高（P<0.05）。見圖5。

圖5 過表達ANKRD1 逆轉(zhuǎn)過表達miR-218-5p 對DEX誘導(dǎo)的人成骨細胞凋亡和炎癥因子表達的影響Fig.5 Overexpression of ANKRD1 reversed the effect of overexpression of miR-218-5p on DEX-induced apoptosis and expressions of inflammatory factors in human osteoblasts

3 討論

糖皮質(zhì)激素在臨床中廣泛應(yīng)用，但具有較多不良反應(yīng)，如導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死等疾病的發(fā)生［12］。目前認為糖皮質(zhì)激素對成骨細胞活性的抑制和凋亡的促進作用是糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的主要病因之一［13］。因此，抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡對于治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松具有積極作用。地塞米松是常用的治療炎癥性、自身免疫性疾病的糖皮質(zhì)激素類藥物，長期使用可引起骨質(zhì)疏松，甚至骨壞死［14］。本研究顯示，地塞米松可促進成骨細胞凋亡及炎癥因子IL-6、IL-1β 和TNF-α表達，與既往研究結(jié)果一致［3］。提示地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞損傷模型建立成功。

miRNA 參與調(diào)控細胞增殖和凋亡等過程，與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究已表明，多種miRNAs 參與調(diào)控成骨細胞、破骨細胞的增殖活性及凋亡，在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。ZHUANG 等［15］研究顯示，抑制miR-107 可靶向上調(diào)CAB39 并激活A(yù)MPK-Nrf2 信號保護成骨細胞免受地塞米松誘導(dǎo)的氧化損傷和細胞毒性；QU等［16］研究顯示，miR-218 通過抑制p38MAPK-c-Fos-NFATc1 通路抑制破骨細胞的生成和骨吸收，可作為骨質(zhì)疏松癥治療的潛在分子靶點；LI 等［17］研究顯示，miR-22 可通過靶向抑制Sirtuin 1 表達來加劇地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞損傷，miR-22 可能是糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的潛在治療靶點。

本研究顯示，地塞米松可抑制成骨細胞中miR-218-5p 表達，提示miR-218-5p 可能參與地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞損傷過程；過表達miR-218-5p 降低了地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡率，說明過表達miR-218-5p 可減少地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡。細胞凋亡受多種基因分子調(diào)控，其中Bax/Bcl-2 在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Bax 是促凋亡分子，其表達增加可形成同源二聚體，改變線粒體膜通透性，導(dǎo)致細胞色素C釋放量增加，進而誘導(dǎo)細胞凋亡；Bcl-2是抗凋亡分子，其表達增加時與Bax 形成異源二聚體，減弱Bax 的促凋亡作用［18-19］。本研究顯示，過表達miR-218-5p 抑制了地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞中Bax 蛋白表達，促進了Bcl-2 蛋白表達，提示過表達miR-218-5p 可能通過調(diào)控Bax/Bcl-2 來抑制地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡。

近年來，臨床和實驗室研究均表明，過量的炎癥因子如IL-6、IL-1β 和TNF-α 可損傷成骨細胞炎癥浸潤，進而引起其凋亡，是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要因素之一［20］。報道稱，骨質(zhì)疏松患者血清中IL-1、IL-6 和TNF-α 水平明顯升高，經(jīng)治療后其表達水平降低，這些炎癥因子參與骨質(zhì)疏松的發(fā)展進程［21］。本研究顯示，過表達miR-218-5p 可抑制地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞表達IL-6、IL-1β 和TNF-α，提示過表達miR-218-5p 可降低地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞炎癥損傷。

為進一步探究過表達miR-218-5p 減輕地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞損傷的影響機制，本研究首先利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了miR-218-5p 可靶向結(jié)合ANKRD1；同時，過表達miR-218-5p 抑制了成骨細胞凋中ANKRD1 表達，進一步說明miR-218-5p 可靶向結(jié)合并負調(diào)控ANKRD1 表達。本研究顯示，地塞米松可促進成骨細胞中ANKRD1 表達，而敲減ANKRD1 減少了地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡及炎癥因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 表達，說明敲減ANKRD1 可減輕地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞損傷。本研究還顯示，過表達ANKRD1 可部分逆轉(zhuǎn)過表達miR-218-5p 對地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡及炎癥因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 表達的抑制作用，提示miR-218-5p 通過靶向負調(diào)控ANKRD1 來減輕地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞損傷。

綜上，地塞米松可抑制成骨細胞中miR-218-5p表達，過表達miR-218-5p 可有效抑制地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡及炎癥因子表達，減輕成骨細胞損傷，其作用機制可能與靶向下調(diào)ANKRD1 有關(guān)，miR-218-5p/ANKRD1 軸可能為糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的治療提供新的分子靶點。