陳 晨 鄭潤泉 李宗玉 （中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第960醫(yī)院骨科，濟南 250031）

地塞米松（dexamethasone，DEX）等糖皮質激素廣泛應用于臨床抗炎、免疫調節(jié)等方面，但糖皮質激素的長期使用可導致糖皮質激素性骨質疏松等并發(fā)癥［1］。糖皮質激素性骨質疏松是臨床常見的繼發(fā)性骨質疏松類型，其發(fā)病率僅次于絕經(jīng)后骨質疏松和老年學骨質疏松［2］。研究表明，糖皮質激素性骨質疏松發(fā)生發(fā)展的原因在于糖皮質激素可抑制骨細胞形成，促使其凋亡［3］。目前，通過干預相關基因減少成骨細胞凋亡是研究的熱點。微小RNA（miRNA）是一類參與調控細胞增殖、分化和凋亡等生命過程的小分子非編碼RNA，在骨質疏松癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［4-6］。研究顯示，絕經(jīng)后骨質疏松癥小鼠骨髓間充質干細胞中miR-218-5p 表達下調，上調miR-218-5p 可促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，緩解絕經(jīng)后骨質疏松癥［7］。但目前miR-218-5p 對糖皮質激素引起的成骨細胞損傷的影響和機制仍不明確。Starbase 生物在線軟件預測顯示，錨蛋白重復域1（ANKRD1）可能是miR-218-5p的靶基因。ANKRD1 是錨定重復蛋白家族成員，參與調控細胞增殖和凋亡等過程［8-9］。有報道稱，ANKRD1 在骨質疏松癥患者中表達升高，可能參與調節(jié)骨骼肌細胞分化［10］。本研究以人成骨細胞HFOB1.19 為研究對象，探究miR-218-5p 對地塞米松誘導的HFOB1.19 細胞凋亡和炎癥因子表達的影響，及其能否靶向調控ANKRD1 發(fā)揮作用，以期了解miR-218-5p/ANKRD1 軸對糖皮質激素性骨質疏松發(fā)生發(fā)展的影響，并為其治療提供分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人成骨細胞HFOB1.19 購自杭州仟諾生物科技有限公司；地塞米松購自美國Sigma公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青；α-MEM 培養(yǎng)基、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；LipofectamineTM2000 試劑盒、Trizol 試劑購自美國Invitrogen公司；miR-218-5p模擬物（mimics）、模擬對照序列（miR-NC）、亂序無意義陰性序列（si-NC）、ANKRD1 小干擾RNA（si-ANKRD1）、ANKRD1 過表達載體（pcDNA-ANKRD1）、空載體（pcDNA）、ANKRD1野生型質粒（WT-ANKRD1）、突變型質粒（MUTANKRD1）及PCR 引物購自上海生工生物工程有限公司；逆轉錄試劑盒、PCR 試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；IL-6、IL-1β 和TNF-α 試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗人B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白（Bax）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染 復蘇HFOB1.19細胞，用含10%FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基（常規(guī)培養(yǎng)基）培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的HFOB1.19 細胞以5.0×105個/孔接種于6 孔板，利用LipofectamineTM2000 試劑盒采用脂質體法分別轉染miR-NC、miR-218-5p mimics、si-NC、si-ANKRD1，共轉染miR-218-5p mimics 與pc-DNA-ANKRD1、miR-218-5p mimics 與pcDNA。轉染6 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞備用。

1.2.2 細胞分組處理 未轉染及轉染后的HFOB1.19 細胞均以5.0×105個/孔接種于6 孔板。其中未轉染的HFOB1.19 細胞分為對照組和DEX組，對照組細胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，DEX組細胞用含10 μmol/L DEX 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h［11］。轉染miR-NC、miR-218-5p mimics、si-NC、si-ANKRD1，共轉染miR-218-5p mimics與pcDNA-ANKRD1、miR-218-5p mimics 與pcDNA 的細胞均用含10μmol/L DEX的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，并分別記為DEX+miR-NC 組、DEX+miR-218-5p 組、DEX+si-NC 組、DEX+si-ANKRD1 組、DEX+miR-218-5p+pcDNA-ANKRD1 組、DEX+miR-218-5p+pcDNA 組。培養(yǎng)結束后，收集各組細胞及細胞培養(yǎng)上清液備用。實驗重復3次。

1.2.3 RT-qPCR 檢測細胞中miR-218-5p 和ANKRD1 mRNA 表達 Trizol 試劑提取各組細胞總RNA，逆轉錄為cDNA 后，行PCR 擴增。擴增程序：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35個循環(huán)。miR-218-5p 正向引物：5'-GATGAAGGTTTCCCACCTTGTC-3'，反向引物：5'-GACTGGGAGA‐AGTGGGTCTG-3'；U6 正向引物：5'-GCGAGATAG‐TAGCGAAGCA-3'，反向引物：5'-CGACGACGCTTC‐GCGCTCG-3'；ANKRD1 正向引物：5'-GATCGAATTCCGTGATATGCT-3'，反向引物：5'-AAACATC‐CAGGTTTCCTCCA-3'；GAPDH 正向引物：5'-CG‐CAGCATACTTAATAAACCG-3'，反向引物：5'-GGT‐GGCGAGAGTCTAAG-3'。2?ΔΔCt法計算miR-218-5p相對于U6、ANKRD1 相對于GAPDH的表達水平。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 將各組細胞用PBS溶液清洗2次，并調整細胞密度為1.0×106個/ml。取1.0 ml 細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。加500 μl 結合緩沖液，混懸細胞后，分別加10 μl Annexin V-FITC 和5μl PI，室溫避光孵育15 min 后，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 Western blot 檢測Bcl-2 和Bax 蛋白表達 RIPA 試劑提取各組細胞總蛋白，BCA 法測蛋白含量，行10%SDS-PAGE 電泳。電泳后，將分離蛋白轉至PVDF膜，于5%脫脂奶粉中封閉1 h。分別于Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）一抗中4 ℃孵育過夜。再于山羊抗兔二抗（1∶2 000）中37 ℃孵育1 h。加化學發(fā)光試劑避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6 ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-1β和TNF-α 水平 將收集的各組細胞培養(yǎng)上清液以3 500 r/min 離心5 min，保留上清。分別參照IL-6、IL-1β 和TNF-α ELISA 試劑盒說明書檢測其在上清中的水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗 將HFOB1.19細胞以5.0×105個/孔接種于6 孔板，LipofectamineTM2000試劑盒采用脂質體法分別共轉染W(wǎng)T-ANKRD1與miR-NC 或miR-218-5p mimic、MUT-ANKRD1 與miR-NC 或miR-218-5p mimic。轉染6 h 后，更換培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，收集細胞并裂解，檢測熒光素酶活性，具體操作參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DEX 對人成骨細胞中miR-218-5p 和ANKRD1表達的影響 與對照組相比，DEX 組成骨細胞中miR-218-5p 表達水平降低（P<0.05），ANKRD1 mRNA和蛋白表達水平升高（P<0.05）。見圖1。

圖1 miR-218-5p和ANKRD1在DEX誘導的成骨細胞中的表達Fig.1 Expressions of miR-218-5p and ANKRD1 in DEXinduced osteoblasts

2.2 過表達miR-218-5p對DEX 誘導的人成骨細胞損傷的影響 與對照組相比，DEX 組成骨細胞凋亡率和Bax 蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低，IL-6、IL-1β 和TNF-α 表達水平升高（P<0.05）。與DEX+miR-NC 組相比，DEX+miR-218-5p 組成骨細胞中miR-218-5p 表達升高，細胞凋亡率和Bax 蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，IL-6、IL-1β和TNF-α表達水平降低（P<0.05）。見圖2。

圖2 過表達miR-218-5p 對DEX 誘導的人成骨細胞凋亡及炎癥因子表達的影響Fig.2 Effect of overexpression of miR-218-5p on DEX-in?duced apoptosis and expressions of inflammatory factors in human osteoblasts

2.3 miR-218-5p靶向調控ANKRD1表達 Starbase生物在線軟件預測顯示，miR-218-5p 與ANKRD1 的核苷酸序列存在連續(xù)結合位點，見圖3A。共轉染miR-218-5p mimics與WT-ANKRD1的細胞熒光素酶活性顯著低于共轉染miR-NC 與WT-ANKRD1 的細胞（0.39±0.02vs1.01±0.05，t=11.527，P<0.05），而共轉染miR-218-5p mimics 與MUT-ANKRD1 的細胞熒光素酶活性與共轉染miR-NC與MUT-ANKRD1的細胞比較差異無統(tǒng)計學意義（0.99±0.04vs1.02±0.05，t=0.369，P=0.731），提示miR-218-5p 可靶向結合ANKRD1，見圖3B。與轉染miR-NC 的細胞相比，轉染miR-218-5p mimics 的細胞中ANKRD1 蛋白表達降低（0.45±0.02vs1.01±0.05，t=18.011，P<0.05，圖3C）。

圖3 miR-218-5p靶向調控ANKRD1表達Fig.3 miR-218-5p target regulated expression of ANKRD1

2.4 敲減ANKRD1對DEX 誘導的人成骨細胞損傷的影響 與DEX+si-NC 組相比，DEX+si-ANKRD1組成骨細胞中ANKRD1 蛋白表達降低，細胞凋亡率和Bax 蛋白表達降低，Bcl-2 蛋白表達升高，IL-6、IL-1β和TNF-α表達水平降低（P<0.05）。見圖4。

圖4 敲減ANKRD1 對DEX 誘導的人成骨細胞凋亡及炎癥因子表達的影響Fig.4 Effect of knockdown of ANKRD1 on DEX-induced apoptosis and expressions of inflammatory factors in human osteoblasts

2.5 過表達ANKRD1 逆轉過表達miR-218-5p 對DEX 誘導的人成骨細胞損傷的影響 與DEX+miR-218-5p+pcDNA 組相比，DEX+miR-218-5p+pcDNAANKRD1 組成骨細胞中ANKRD1 蛋白表達升高，細胞凋亡率和Bax 蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低，IL-6、IL-1β 和TNF-α 表達水平升高（P<0.05）。見圖5。

圖5 過表達ANKRD1 逆轉過表達miR-218-5p 對DEX誘導的人成骨細胞凋亡和炎癥因子表達的影響Fig.5 Overexpression of ANKRD1 reversed the effect of overexpression of miR-218-5p on DEX-induced apoptosis and expressions of inflammatory factors in human osteoblasts

3 討論

糖皮質激素在臨床中廣泛應用，但具有較多不良反應，如導致骨質疏松、股骨頭壞死等疾病的發(fā)生［12］。目前認為糖皮質激素對成骨細胞活性的抑制和凋亡的促進作用是糖皮質激素性骨質疏松的主要病因之一［13］。因此，抑制糖皮質激素誘導的成骨細胞凋亡對于治療糖皮質激素性骨質疏松具有積極作用。地塞米松是常用的治療炎癥性、自身免疫性疾病的糖皮質激素類藥物，長期使用可引起骨質疏松，甚至骨壞死［14］。本研究顯示，地塞米松可促進成骨細胞凋亡及炎癥因子IL-6、IL-1β 和TNF-α表達，與既往研究結果一致［3］。提示地塞米松誘導的成骨細胞損傷模型建立成功。

miRNA 參與調控細胞增殖和凋亡等過程，與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究已表明，多種miRNAs 參與調控成骨細胞、破骨細胞的增殖活性及凋亡，在骨質疏松的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。ZHUANG 等［15］研究顯示，抑制miR-107 可靶向上調CAB39 并激活AMPK-Nrf2 信號保護成骨細胞免受地塞米松誘導的氧化損傷和細胞毒性；QU等［16］研究顯示，miR-218 通過抑制p38MAPK-c-Fos-NFATc1 通路抑制破骨細胞的生成和骨吸收，可作為骨質疏松癥治療的潛在分子靶點；LI 等［17］研究顯示，miR-22 可通過靶向抑制Sirtuin 1 表達來加劇地塞米松誘導的成骨細胞損傷，miR-22 可能是糖皮質激素性骨質疏松的潛在治療靶點。

本研究顯示，地塞米松可抑制成骨細胞中miR-218-5p 表達，提示miR-218-5p 可能參與地塞米松誘導的成骨細胞損傷過程；過表達miR-218-5p 降低了地塞米松誘導的成骨細胞凋亡率，說明過表達miR-218-5p 可減少地塞米松誘導的成骨細胞凋亡。細胞凋亡受多種基因分子調控，其中Bax/Bcl-2 在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Bax 是促凋亡分子，其表達增加可形成同源二聚體，改變線粒體膜通透性，導致細胞色素C釋放量增加，進而誘導細胞凋亡；Bcl-2是抗凋亡分子，其表達增加時與Bax 形成異源二聚體，減弱Bax 的促凋亡作用［18-19］。本研究顯示，過表達miR-218-5p 抑制了地塞米松誘導的成骨細胞中Bax 蛋白表達，促進了Bcl-2 蛋白表達，提示過表達miR-218-5p 可能通過調控Bax/Bcl-2 來抑制地塞米松誘導的成骨細胞凋亡。

近年來，臨床和實驗室研究均表明，過量的炎癥因子如IL-6、IL-1β 和TNF-α 可損傷成骨細胞炎癥浸潤，進而引起其凋亡，是骨質疏松癥發(fā)病的重要因素之一［20］。報道稱，骨質疏松患者血清中IL-1、IL-6 和TNF-α 水平明顯升高，經(jīng)治療后其表達水平降低，這些炎癥因子參與骨質疏松的發(fā)展進程［21］。本研究顯示，過表達miR-218-5p 可抑制地塞米松誘導的成骨細胞表達IL-6、IL-1β 和TNF-α，提示過表達miR-218-5p 可降低地塞米松誘導的成骨細胞炎癥損傷。

為進一步探究過表達miR-218-5p 減輕地塞米松誘導的成骨細胞損傷的影響機制，本研究首先利用雙熒光素酶報告基因實驗證實了miR-218-5p 可靶向結合ANKRD1；同時，過表達miR-218-5p 抑制了成骨細胞凋中ANKRD1 表達，進一步說明miR-218-5p 可靶向結合并負調控ANKRD1 表達。本研究顯示，地塞米松可促進成骨細胞中ANKRD1 表達，而敲減ANKRD1 減少了地塞米松誘導的成骨細胞凋亡及炎癥因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 表達，說明敲減ANKRD1 可減輕地塞米松誘導的成骨細胞損傷。本研究還顯示，過表達ANKRD1 可部分逆轉過表達miR-218-5p 對地塞米松誘導的成骨細胞凋亡及炎癥因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 表達的抑制作用，提示miR-218-5p 通過靶向負調控ANKRD1 來減輕地塞米松誘導的成骨細胞損傷。

綜上，地塞米松可抑制成骨細胞中miR-218-5p表達，過表達miR-218-5p 可有效抑制地塞米松誘導的成骨細胞凋亡及炎癥因子表達，減輕成骨細胞損傷，其作用機制可能與靶向下調ANKRD1 有關，miR-218-5p/ANKRD1 軸可能為糖皮質激素性骨質疏松的治療提供新的分子靶點。