張 馳 李姝薈 周鴻媛 郭 婷 張宇昊 馬 良

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

玉米赤霉烯酮是糧食安全領(lǐng)域重點(diǎn)研究的真菌毒素之一［1-2］。α-玉米赤霉烯醇（α-Zearalenol，α-ZOL）是玉米赤霉烯酮在人畜體內(nèi)代謝后的主要代謝產(chǎn)物［3-4］，主要毒性表現(xiàn)為雌激素作用，且高于母體毒素3～4倍，嚴(yán)重危害動(dòng)物生產(chǎn)性能和人類健康［5-7］。目前利用食源性天然成分的生物活性干預(yù)危害因子毒性已成為研究熱點(diǎn)之一［8-12］。

槲皮素（quercetin，Que）是一種廣泛存在于蔬菜、水果中的膳食多酚類黃酮化合物［13-14］，具有多種生物學(xué)活性及很高的藥用價(jià)值，在營(yíng)養(yǎng)干預(yù)及多種疾病模型的防治中受到廣泛關(guān)注［15-17］。如前期報(bào)道，Que可以提高核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)、抗氧化酶活性和總抗氧化能力，從而有效調(diào)節(jié)T-2［18］、黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）［19］和赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）［20］引起的氧化應(yīng)激，顯示出良好的抗氧化活性。體外模擬研究證明Que對(duì)人血清白蛋白上結(jié)合的α-ZOL有競(jìng)爭(zhēng)取代作用［21］；因此，本研究利用α-ZOL誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞建立氧化損傷模型，從氧化應(yīng)激、線粒體功能和細(xì)胞凋亡等方面研究Que對(duì)α-ZOL誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷的影響和相關(guān)機(jī)制，以期為利用具有生物活性的天然產(chǎn)物降低真菌誘導(dǎo)的毒性損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2來(lái)源于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection，APCC）細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 藥物與試劑槲皮素（Que），純度≥97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；α-玉米赤霉烯醇（α-ZOL），純度≥99%，新加坡Pribolab公司；不完全高糖培養(yǎng)基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM），江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞增殖及毒性（Cell Counting Kit-8，CCK-8）檢測(cè)試劑盒，南京草本源生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒，上海貝博生物科技有限公司；吖啶橙（acridine orange，AO）染色液，北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶活性（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒、2，2'-二辛可寧酸（2，2'-bicinchonininc acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒-熒光探針?lè)ǎ?，5'，6，6'-Tetrachloro-1，1'，3，3'-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide，JC-1）、膜聯(lián)蛋白V-熒光素異硫氰酸酯（annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗半胱天冬酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）、一抗核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor-2，Nrf2）、一抗B淋巴細(xì)胞瘤-2（b-cell lymphoma-2，Bcl-2）、辣根過(guò)氧化生物酶HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，美國(guó)Abcam公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備371型二氧化碳培養(yǎng)箱、ST40R型冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；IX73型熒光顯微鏡，日本Olympus公司；SYNERGY2型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；BD FACSVerse型流式細(xì)胞儀，美國(guó)Becton Dickison公司；DYCZ-24DN型垂直電泳槽，北京六一儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Caco-2細(xì)胞存活率及ROS、MDA和SOD水平的測(cè)定a.細(xì)胞處理：Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，鏡下觀察貼壁生長(zhǎng)；吸除DMEM培養(yǎng)基，先分別用含有濃度為0、20、40、60 μmol·L-1Que的DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理24 h，吸除培養(yǎng)基，然后再用含有濃度為0、20、40、60 μmol·L-1α-ZOL的培養(yǎng)基作用24 h。b.培養(yǎng)結(jié)束后，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組中細(xì)胞存活率及MDA含量和ROS、SOD活力。

1.2.2 Caco-2細(xì)胞中ATP和線粒體膜電位的測(cè)定ATP水平檢測(cè)方法：不同藥物處理結(jié)束后（同1.2.1a），用4℃預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）緩慢清洗一次，每孔加入200μL ATP檢測(cè)裂解液，適當(dāng)吹打，于4℃、12 000×g條件下離心5 min，取上清，按照試劑盒說(shuō)明書操作。根據(jù)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的ATP濃度。

線粒體膜電位檢測(cè)方法：不同藥物處理結(jié)束后，每孔加入1 mL JC-1工作液，在37℃孵箱中培養(yǎng)20 min，用現(xiàn)配的JC-1染色緩沖液（1×）洗滌兩次，加入1 mL DMEM培養(yǎng)基，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 Caco-2細(xì)胞凋亡的觀察及檢測(cè)Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染觀察細(xì)胞死亡情況：不同藥物處理結(jié)束后（同1.2.1a），每孔加入1 mL細(xì)胞染色緩沖液，隨后加入5μL Hoechst染色液、5 μL PI染色液并混勻，37℃孵育25 min，結(jié)束后用熒光顯微鏡觀察。

AO染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化：不同藥物處理結(jié)束后（同1.2.1a），每孔加入1 mL用PBS配置好的濃度為10 μg·mL-1的AO染色工作液，輕輕混勻，室溫避光染色20 min，結(jié)束培養(yǎng)后，于熒光顯微鏡下觀察。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：不同藥物處理結(jié)束后，加入200μL胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用195μL熒光探針異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白（Annexin V），即Annexin V-FITC重懸細(xì)胞，再加入5μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，最后加入10μL PI染色液，輕輕混勻。室溫下避光孵育15 min后，1 000×g離心5 min，棄上清，用PBS重懸洗滌未結(jié)合的染色液，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 蛋白免疫印跡分析接種Caco-2細(xì)胞于六孔板中，不同藥物處理結(jié)束后（同1.2.1a），用PBS洗滌，加入細(xì)胞裂解液（radio immunoprecipitation assay，RIPA）于冰上裂解30 min，離心取上清，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。隨后，取30μg變性蛋白上樣，采用凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane，NC膜），用5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入相應(yīng)一抗（Nrf2，1∶1 000；Bcl-2，1∶1 000；Caspase-3，1∶1 000），4℃封閉過(guò)夜，洗滌緩沖液洗3次，加二抗（1∶1 000）封閉液封閉1 h，采用化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）發(fā)光法顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析數(shù)據(jù)，使用Duncan's多重比較法進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。使用Origin 9軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Que對(duì)α-ZOL誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞活力的影響

由圖1-A可知，α-ZOL對(duì)Caco-2細(xì)胞活力具有明顯的抑制作用，其半抑制濃度（IC50）為82.94μmol·L-1。當(dāng)Que濃度低于80μmol·L-1時(shí)，隨著Que濃度的升高，Caco-2細(xì)胞活力均有不同程度的升高，但Que濃度為80μg·mL-1和160μg·mL-1時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖出現(xiàn)抑制作用，這可能是因?yàn)楦邉┝康腝ue可以在離體線粒體和培養(yǎng)的細(xì)胞中增強(qiáng)O2－·的生成，降低細(xì)胞總抗氧化能力［22］。

圖1 Que對(duì)α-ZOL誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞損傷的影響Fig.1 Effect of Que on Caco-2 cell injury induced by α-ZOL

Que對(duì)α-ZOL誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞存活率的影響如圖1-B所示，相比20、40、60μmol·L-1α-ZOL單獨(dú)處理組，經(jīng)過(guò)20、40、60μmol·L-1Que預(yù)處理的細(xì)胞存活率有所提高，其中40 μmol·L-1Que下的細(xì)胞存活率最大。對(duì)此組進(jìn)行Hoechst 33342/PI雙染觀察，結(jié)果如圖1-C所示，α-ZOL引起細(xì)胞核染色質(zhì)凝集、濃縮，最終形成凋亡小體，表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的典型特征；Que在該過(guò)程中起到了保護(hù)作用，與40μmol·L-1α-ZOL組相比，40 μmol·L-1Que+40 μmol·L-1α-ZOL組染色細(xì)胞數(shù)明顯減少，凋亡細(xì)胞比例減少，細(xì)胞凋亡有明顯改善。但經(jīng)高濃度的α-ZOL（60μmol?L-1）暴露細(xì)胞24 h后，60μmol?L-1Que預(yù)處理達(dá)不到改善的效果。因此，60 μmol?L-1α-ZOL和Que不作為后續(xù)試驗(yàn)中的給藥劑量。

2.2 Que對(duì)α-ZOL誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的影響

由圖2-A可知，細(xì)胞內(nèi)的ROS熒光強(qiáng)度隨α-ZOL濃度的增加而增強(qiáng)，而Que的干預(yù)使各α-ZOL濃度誘導(dǎo)的熒光強(qiáng)度明顯減弱。由圖2-B～D可知，α-ZOL使細(xì)胞內(nèi)的ROS、MDA水平顯著升高，SOD活力降低；20、40 μmol·L-1Que的干預(yù)使ROS、MDA水平顯著低于α-ZOL組，SOD相對(duì)活力呈量效關(guān)系。由此說(shuō)明，細(xì)胞經(jīng)α-ZOL處理后發(fā)生了較嚴(yán)重的損傷，而Que可通過(guò)有效清除自由基和增強(qiáng)細(xì)胞自身的抗氧化能力來(lái)緩解活性氧對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化損傷的影響，進(jìn)而減輕α-ZOL誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。其中，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)40μmol?L-1Que預(yù)處理，再經(jīng)40μmol?L-1α-ZOL暴露24 h時(shí)的改善效果最佳。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中統(tǒng)一采用此濃度模型進(jìn)行干預(yù)。

圖2 Que對(duì)α-ZOL誘導(dǎo)氧化損傷的影響Fig.2 Effect of Que on cell oxidative damage by α-ZOL

2.3 Que對(duì)α-ZOL誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞線粒體功能的影響

ATP和線粒體膜電位的變化與活性氧自由基的產(chǎn)生有關(guān)，當(dāng)細(xì)胞受到毒性物質(zhì)的刺激發(fā)生凋亡或壞死時(shí)，由于氧化應(yīng)激而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷甚至死亡將伴隨兩者水平的降低，表明線粒體的功能受損或下降［23-24］。由圖3可知，與對(duì)照組相比，α-ZOL組ATP相對(duì)含量和紅綠熒光強(qiáng)度比值顯著降低，說(shuō)明線粒體功能受損；而與α-ZOL組相比，Que的干預(yù)可使ATP相對(duì)含量提高3個(gè)百分點(diǎn)，紅綠熒光強(qiáng)度比值提高9%。結(jié)果表明，Que可抑制α-ZOL引起的ATP含量和線粒體膜電位降低，使得細(xì)胞有足夠的能量物質(zhì)來(lái)源以適應(yīng)α-ZOL對(duì)線粒體造成的損害作用，從而維持氧化應(yīng)激條件下線粒體正常的生理功能。

圖3 Que對(duì)α-ZOL誘導(dǎo)線粒體功能損傷的影響Fig.3 Effect of Que on mitochondrial function injury by α-ZOL

Que組的ATP水平下降可能是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)ATP與二磷酸腺苷（adenosine diphosphate A，ADP）是動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)系，ATP/ADP比例適當(dāng)下降，通常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)二氧化碳的積累，從而刺激呼吸作用產(chǎn)生，促進(jìn)線粒體代謝［25］。

2.4 Que對(duì)α-ZOL誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞凋亡的影響

由圖4-A可知，Que組和對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)正常，并呈現(xiàn)出均勻的淺綠色熒光。α-ZOL使細(xì)胞產(chǎn)生了核濃染及碎片化的現(xiàn)象，發(fā)出亮綠色熒光（圖中箭頭所指示），而Que的干預(yù)減少了不規(guī)則碎片細(xì)胞的出現(xiàn)，降低了致密濃染的程度，表明40μmol·L-1Que可減輕α-ZOL引起的細(xì)胞核DNA受損程度，從而降低細(xì)胞凋亡數(shù)。由圖4-B可知，相較于對(duì)照組，α-ZOL組細(xì)胞凋亡率明顯著增加，而Que的干預(yù)使細(xì)胞凋亡率有所降低，表明Que可通過(guò)減弱α-ZOL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)細(xì)胞。

圖4 Que對(duì)α-ZOL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of Que on cell morphology induced by α-ZOL

2.5 Que對(duì)α-ZOL誘導(dǎo)Nrf2、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

采用蛋白免疫印跡（western blotting，WB）分析抗氧化蛋白Nrf2、抗凋亡蛋白Bcl-2以及促凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，40μmol·L-1Que組能夠上調(diào)Nrf2和Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Caspase-3的表達(dá)；與α-ZOL組相比，40μmol·L-1Que+40μmol·L-1α-ZOL能夠?qū)rf2、Bcl-2和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平恢復(fù)至正常水平，說(shuō)明Que+40μmol·L-1α-ZOL能夠?qū)沟蛲龌駼cl-2進(jìn)行合理的調(diào)控，進(jìn)一步下調(diào)Caspase-3活性從而抑制α-ZOL誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞凋亡。

圖5 各組Nrf2、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)水平Fig.5 Nrf2，Bcl-2 and Caspase-3 protein expression levels in each group

3 討論

本研究中α-ZOL誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，破壞細(xì)胞的氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)，降低胞內(nèi)抗氧化酶系的活力，致使胞內(nèi)的氧化與抗氧化之間的平衡被打破，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的氧化損傷，這與目前報(bào)道α-ZOL對(duì)多種機(jī)體細(xì)胞有毒性作用，且產(chǎn)生毒性的機(jī)制主要是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激［26-27］的研究結(jié)果一致。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)α-ZOL誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷還與其損傷線粒體功能以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，α-ZOL誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生并引發(fā)線粒體膜電位降低，抑制ATP合成，導(dǎo)致線粒體功能受損繼而啟動(dòng)細(xì)胞線粒體途徑凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3，從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了α-ZOL毒性作用機(jī)制。

線粒體內(nèi)已形成一套有效的抗氧化系統(tǒng)專門用于去除各種類型的ROS或修復(fù)生物分子的氧化損傷［28-29］，一種可能的保護(hù)策略是用抗氧化劑豐富組織線粒體，從而限制線粒體氧化損傷、細(xì)胞損傷以及毒性的發(fā)生和發(fā)展［30］。本研究發(fā)現(xiàn)Que處理可緩解α-ZOL對(duì)細(xì)胞的損傷，究其原因，一方面槲皮素對(duì)ROS引起的線粒體損傷具有保護(hù)作用，可以提高ATP水平和線粒體膜電位，并且通過(guò)Bcl-2蛋白調(diào)控線粒體途徑來(lái)下調(diào)Caspase-3表達(dá)量，從而使Bcl-2得以表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡；另一方面槲皮素可能提升了內(nèi)源性抗氧化劑的生成能力從而使其體現(xiàn)出良好的抗氧化能力，通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路的核轉(zhuǎn)移來(lái)提高SOD活力，清除由α-ZOL誘導(dǎo)產(chǎn)生的過(guò)多ROS，進(jìn)而緩解α-ZOL誘導(dǎo)細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了前人關(guān)于Que在細(xì)胞抗氧化、抗凋亡及保護(hù)線粒體方面起重要作用的結(jié)論［31］。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，Que干預(yù)α-ZOL誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷，明顯降低Caco-2細(xì)胞ROS水平、MDA含量，提高SOD活力；同時(shí)維持線粒體膜電位、ATP含量以減輕線粒體受損程度，有效減輕α-ZOL對(duì)Caco-2細(xì)胞造成的毒性損傷。為控制α-ZOL危害，進(jìn)行科學(xué)合理的健康膳食干預(yù)非常重要?；诒驹囼?yàn)研究結(jié)果，Que在生物體內(nèi)的保護(hù)作用及機(jī)制等可在下一步工作中進(jìn)行深入探究。