馬延莉 宋婷婷 魏春雁 徐麗紅 王樹林 李春霖 聶晶 袁玉偉，*

（1浙江省農業(yè)科學院農產品質量安全與營養(yǎng)研究所，浙江杭州 310021；2青海大學農牧學院，青海西寧 810016；3浙江省農業(yè)科學院園藝研究所，浙江杭州310021；4吉林省農業(yè)科學院，吉林長春 130033）

黑木耳（Auricularia auricula）含有豐富的必需氨基酸、蛋白質、礦物質等，作為食用和藥用資源一直備受消費者喜愛［1-2］。由于黑木耳品質會受到產地因素如氣候、代料、水源等的影響［3］，各地黑木耳具有不同的地理標志特色［4］，如東北（黑龍江、吉林、遼寧）3種黑木耳屬于國家地理標志產品［5］，浙江省龍泉市黑木耳獲得國家生態(tài)原產地產品保護［6］，這些地域特征、品牌價值以及黑木耳對健康的益處［7-9］使消費者對黑木耳的需求不斷增加［10］，而市場假冒地理標志和產地產品案件時有發(fā)生。因此，進行黑木耳產地溯源對維護消費者權益、保障市場公平性和產業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。

目前，黑木耳產地溯源判別方法主要有DNA條碼檢測、近紅外光譜儀掃描、氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、主成分分析（principal component analysis，PCA）等。如宋君等［11］利用DNA條碼對黑木耳樣品進行了產地溯源的分子檢測研究；夏珍珍等［12］利用近紅外光譜儀掃描不同主產地的香菇干樣，利用偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）分別建立了不同省份栽培香菇的產地判別模型；楊根［13］利用GC-MS技術檢測不同產地黑木耳，找出了不同產地間的差異；宋婷婷等［14］以8種不同基質配方栽培的雙孢蘑菇為對象，測定4個穩(wěn)定同位素的比例并結合PCA分析表明，可以將不同培養(yǎng)基質配方栽培的雙孢蘑菇有效分為3類，3個主成分的貢獻率為78.2%。以上研究證實，穩(wěn)定同位素技術主要根據同位素分餾效應檢測反應物同位素組成發(fā)生的改變，由此區(qū)分產物的地理來源［15-16］。目前，該技術是國際公認的有效溯源技術之一，已經在葡萄［17］、茶葉［18］、稻米［19］等植物源農產品產地判別應用中取得良好成效。因此，利用穩(wěn)定同位素技術分析不同產地黑木耳樣品δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值并進行產地溯源具有可行性。

本研究在該類研究方法基礎上，針對我國黑木耳原產地判定進行探索，采用元素分析-穩(wěn)定同位素比率質譜儀測定了東北（黑龍江、吉林、遼寧）、浙江產地黑木耳中的穩(wěn)定同位素δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值，分析不同產地的分布特征，利用新疆黑木耳樣品作為外部驗證，結合PLS-DA分析構建黑木耳穩(wěn)定同位素溯源模型，以期為黑木耳產地判定提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗共采集85份黑木耳樣品，其中東北（黑龍江、吉林、遼寧）40份、浙江34份，新疆11份，分別采自各產地代表性產區(qū)木耳種植基地、食用菌合作社等，其中新疆11份樣品用于模型驗證。樣品產地信息見表1。

表1 黑木耳樣品產地及數量Table 1 Origin and quantity of Auricularia auricula samples

穩(wěn)定同位素δ13C標準物質：B2155（蛋白質，δ13CV-PDB=-26.98‰）、IAEA-CH-6（蔗 糖，δ13CV-PDB=-10.45‰），奧地利國際原子能機構；USGS64（甘氨酸，δ13CV-PDB=-40.81‰），美國地質勘探局。

穩(wěn)定同位素δ15N標準物質：B2155（蛋白質，δ15Nair=5.94‰）、IAEA-N-2（硫酸銨，δ15Nair=20.30‰），奧地利國際原子能機構；USGS64（甘氨酸，δ15NairV-PDB=1.76‰），美國地質勘探局。

穩(wěn)定同位素δ2H標準物質：USGS54（加拿大黑松木粉，δ2HV-SNOW=-150.4‰）、USGS56（南非紅象牙木粉，δ2HV-SNOW=-44.00‰），美國地質勘探局。

穩(wěn)定同位素δ18O標準物質：USGS54（加拿大黑松木粉，δ18OV-SNOW=17.79‰）、USGS56（南非紅象牙木粉，δ18OV-SNOW=27.23‰），美國地質勘探局。

1.2 儀器與設備

XP6型天平，瑞士Mettler-Toledo公司；Vario PYRO cube型元素分析儀，德國Elementar公司；Isoprime 100型穩(wěn)定同位素比率質譜儀，英國Isoprime公司；HR2864粉碎機，中國飛利浦電子公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理樣品采集后，去除殘渣進行晾曬。用真空冷凍干燥機干燥后，再用粉碎機將黑木耳樣品進行粉碎處理，過60目篩后裝入樣品袋，在常溫25℃條件下貯存待測。

1.3.2 穩(wěn)定性碳、氮同位素比率檢測稱取大約3～5 mg待測樣，用錫箔杯包好后放置于元素分析儀樣品盤中，碳元素和氮元素通過高溫燃燒后經還原銅轉化為純凈的CO2和N2，進入穩(wěn)定同位素質譜儀檢測。具體條件：元素分析儀氦氣吹掃流量為230 mL·min-1；氧化爐和還原爐溫度分別為1 020和650℃，進入質譜儀載氣氦氣流量為100 mL·min-1。在分析過程中，δ13C檢測以B2155、IAEA-CH-6和USGS64為標樣進行三點校正；δ15N以B2155、IAEA-N-2和USGS64為標樣進行三點校正。

1.3.3 穩(wěn)定性氫、氧同位素比率檢測稱取0.3～0.6 mg樣品，用銀杯包好后放至元素分析儀樣品盤中，氫元素和氧元素經高溫裂解后轉化為純凈的H2和CO，進入穩(wěn)定同位素質譜儀檢測。具體條件：元素分析儀裂解爐溫度為1 450℃，氦氣流量為125 mL·min-1。在分析過程中，δ2H以USGS54、USGS56為標樣進行二點校正；δ18O以USGS54、USGS56為標樣進行二點校正。

穩(wěn)定性同位素比率計算公式如下：

式中，R樣品為所測樣品中重同位素與輕同位素的豐度比，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R標準為國際標準樣品中重同位素與輕同位素的豐度比，其中δ13C以維也納美洲擬箭石為基準，δ15N以大氣中氮氣為基準，δ2H和δ18O以維也納標準平均海洋水為基準。

1.4 模型建立

將東北（黑龍江、吉林、遼寧）40份黑木耳樣品和非東北（浙江和新疆）45份黑木耳樣品隨機分為訓練集（64個）和驗證集（21個），將浙江34份黑木耳樣品和非浙江51份黑木耳樣品（黑龍江、吉林、遼寧、新疆）按數隨機分為訓練集（64個）和驗證集（21個），并保證訓練集和驗證集中不同產地的樣品數量比保持一致，將所有黑木耳樣品的4個穩(wěn)定同位素比值（δ）作為輸入變量，利用XLSTAT 2019軟件建立PLS-DA產地判別模型。

1.5 數據處理

采用單因素方差分析（one way-ANOVA）和PLS-DA對黑木耳原產地進行判別。數據分析前利用Excel 2019將原始數據進行標準化，然后采用SPSS 18.0軟件對數據進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 東北（黑龍江、吉林、遼寧）、浙江兩產地黑木耳δ13C和δ15N特征差異

由表2可知，東北（黑龍江、吉林、遼寧）黑木耳δ13C值的范圍為-24.5‰～-22.7‰，平均值為-23.6‰，浙江黑木耳δ13C值的范圍為-26.2‰～-24.5‰，平均值為-25.2‰，東北（黑龍江、吉林、遼寧）黑木耳δ13C值顯著高于浙江（P<0.05）；東北（黑龍江、吉林、遼寧）黑木耳δ15N值的范圍為-0.9‰～3.1‰，平均值為0.7‰，浙江黑木耳δ15N值的范圍為-0.9‰～1.2‰，平均值為0.4‰，兩產地之間的差異不顯著（P>0.05）；浙江黑木耳δ2H值范圍為-24.9‰～-9.0‰，平均值為-16.6‰，東北（黑龍江、吉林、遼寧）黑木耳δ2H值范圍為-62.2‰～-34.6‰，平均值為-46.7‰，浙江黑木耳δ2H值顯著高于東北（P<0.05）；東北（黑龍江、吉林、遼寧）黑木耳δ18O值范圍為15.9‰～19.4‰，平均值為17.5‰，浙江黑木耳δ18O值范圍為19.9‰～22.2‰，平均值為21.4‰，浙江黑木耳δ18O值顯著高于東北（P<0.05）。

表2 黑木耳穩(wěn)定同位素特征變化Table 2 Changes of stable isotope characteristics of Auricularia auricula /‰

東北（黑龍江、吉林、遼寧）、浙江兩地共74份黑木耳δ13C值頻率直方圖和正態(tài)分布曲線如圖1-A所示。在正態(tài)分布模型中，δ13C值的變化范圍為-26.2‰～-22.7‰，其中東北（黑龍江、吉林、遼寧）黑木耳δ13C值為-24.5‰～-22.7‰，平均值為-23.6‰，浙江黑木耳δ13C值為-26.2‰～-24.5‰，平均值為-25.2‰，東北（黑龍江、吉林、遼寧）顯著高于浙江（P<0.05）。東北、浙江兩產地共74份黑木耳δ15N值頻率直方圖和正態(tài)分布曲線如圖1-B所示，在正態(tài)分布模型中，δ15N值的變化范圍為-0.9‰～3.1‰，其中東北（黑龍江、吉林、遼寧）黑木耳δ15N值為-0.9‰～3.1‰，平均值為0.7‰，浙江黑木耳δ15N值為-0.9‰～1.2‰，平均值為0.4‰，兩產地之間的差異不顯著（P>0.05）。說明δ13C值除了可能與地理經緯度和溫度有關外，還與自然生長環(huán)境中的光照強度、代料基質有關［20］，δ15N值除了可能與地域、基因型、年際有關外，還與代料基質中所用輔料如尿素等中氮的含量有關［21］。

圖1 東北（黑龍江、吉林、遼寧）、浙江黑木耳δ13C和δ15N分布圖Fig.1 Distribution of δ13C and δ15N of Auricularia auricula in Northeast China and Zhejiang Province

2.2 東北（黑龍江、吉林、遼寧）、浙江兩產地黑木耳δ2H和δ18O值特征差異

東北（黑龍江、吉林、遼寧）、浙江兩地共74份黑木耳的δ2H值頻率直方圖和正態(tài)分布曲線如圖2-A所示，在正態(tài)分布模型中，兩產地黑木耳δ2H值的變化范圍為-62.2‰～-9.0‰，其中浙江黑木耳δ2H值為-24.9‰～-9.0‰，平均值為-16.6‰，東北（黑龍江、吉林、遼寧）黑木耳δ2H值為-62.2‰～-34.6‰，平均值為-46.7‰，浙江顯著高于東北（黑龍江、吉林、遼寧）（P<0.05）。東北（黑龍江、吉林、遼寧）、浙江兩產地共74份黑木耳δ18O值頻率直方圖和正態(tài)分布曲線如圖2-B所示，在正態(tài)分布模型中，δ18O值的變化范圍為15.9‰～22.2‰，其中東北（黑龍江、吉林、遼寧）黑木耳δ18O值為15.9‰～19.4‰，平均值為17.5‰，浙江黑木耳δ18O值為19.9‰～22.2‰，平均值為21.4‰，浙江顯著高于東北（黑龍江、吉林、遼寧）（P<0.05）。不同產地黑木耳中δ2H與δ18O值存在差異，這除了與產地氣候有關外，還可能與南北兩地水源δ2H、δ18O值和降雨量不同有關［22-23］。

圖2 東北、浙江黑木耳δ2H和δ18O分布圖Fig.2 Distribution of δ2H and δ18O of Auricularia auricula in Northeast China and Zhejiang Province

2.3 模型構建與產地判別

由表3可知，通過PLS-DA建立的產地判別模型判別函數（F）如下：

表3 東北黑木耳模型PLS-DA判別分析結果Table 3 Results of PLS-DA discriminant analysis of Northeast China Auricularia auricula model

結果表明，訓練集整體判別準確率達到98.4%，其中，東北（黑龍江、吉林、遼寧）黑木耳判別準確率達到100%，非東北（浙江和新疆）黑木耳判別準確率為97.1%，有1個樣品被誤判為東北（黑龍江、吉林、遼寧）。將測試集的21個樣品作為外部驗證的準確率為95.2%，其中東北（黑龍江、吉林、遼寧）黑木耳判別準確率達到100%，非東北（浙江和新疆）黑木耳判別正確率為90.9%，有1個樣品被誤判為東北（黑龍江、吉林、遼寧），綜上所述，此模型可對東北（黑龍江、吉林、遼寧）和非東北（浙江和新疆）黑木耳進行有效的產地判別。

東北（黑龍江、吉林、遼寧）40份樣品和非東北（浙江和新疆）45份樣品PLS-DA模型的訓練集和驗證集樣品得分結果如圖3-A所示，訓練集中R2X（cum）為0.885，R2Y（cum）為0.854。訓練集樣品的分類效果相對驗證集樣品較好，表現為東北（黑龍江、吉林、遼寧）訓練集比較集中，非東北（浙江和新疆）訓練集比較分散，并有個別交叉現象。東北（黑龍江、吉林、遼寧）的黑木耳樣品集中在第一、第四象限，非東北（浙江和新疆）的黑木耳樣品分布在第二、第三、第四象限，而且不同產地的黑木耳樣品比較清晰地分布在各自的區(qū)域，能夠很好地將兩個產地黑木耳進行有效識別。東北（黑龍江、吉林、遼寧）黑木耳穩(wěn)定同位素VIP貢獻圖如圖3-B所示，各同位素的貢獻度不同，其中δ18O值的貢獻度最大，貢獻度大于1的是δ18O和δ2H值，貢獻度小于1的是δ13C和δ15N值。

圖3 東北黑木耳模型PLS-DA分析圖（A）與VIP圖（B）Fig.3 PLS-DA analysis diagram（A）and VIP diagram（B）of northeast Auricularia auricula model

由表4可知，通過PLS-DA建立的產地判別模型判別函數（F）如下：

表4 浙江黑木耳模型PLS-DA判別分析結果Table 4 Results of PLS-DA discriminant analysis of Zhejiang Auricularia auricula model

訓練集64個樣品整體判別準確率達到100%，其中，浙江和非浙江（黑龍江、吉林、遼寧、新疆）黑木耳判別準確率均達到100%。將測試集的21個樣品作為外部驗證的準確率為100%，浙江和非浙江（黑龍江、吉林、遼寧、新疆）黑木耳判別正確率均達到100%，沒有黑木耳樣品被誤判。綜上，此模型同樣可對浙江和非浙江（黑龍江、吉林、遼寧、新疆）黑木耳進行非常有效的產地判別。

浙江34份樣品和非浙江（黑龍江、吉林、遼寧、新疆）51份樣品PLS-DA模型的訓練集和驗證集樣品得分結果如圖4-A所示，訓練集中R2X（cum）為0.828，R2Y（cum）為0.922。訓練集樣品和驗證集樣品的分類效果相比：浙江訓練集比較集中，非浙江（黑龍江、吉林、遼寧、新疆）訓練集比較分散，并有個別交叉現象。浙江的黑木耳樣品集中在第一、第四象限，非浙江（黑龍江、吉林、遼寧、新疆）的黑木耳樣品分布在第二、第三象限，而且不同產地的黑木耳樣品比較清晰地分布在各自的區(qū)域，能夠很好地將兩個產地黑木耳進行有效識別。浙江黑木耳穩(wěn)定同位素VIP貢獻圖如圖4-B所示，δ18O值的貢獻度最大，δ2H值的貢獻度與δ18O值相近，貢獻度大于1的是δ18O、δ2H和δ13C值，貢獻度小于1的是δ15N值。

圖4 浙江黑木耳模型PLS-DA分析圖（A）與VIP圖（B）Fig.4 PLS-DA analysis diagram（A）and VIP diagram（B）of Zhejiang Auricularia auricula model

3 討論

本研究利用東北（黑龍江、吉林、遼寧）和浙江兩地黑木耳樣品分析穩(wěn)定同位素比值分布及其變化情況，證實東北（黑龍江、吉林、遼寧）和浙江兩地黑木耳δ13C、δ2H和δ18O值呈現顯著差異，具有一定的地域特征。農產品δ13C值范圍因光合途徑不同而異，黑木耳不能進行光合作用，因此黑木耳中δ13C值的差異主要來源于不同栽培基質，如東北（黑龍江、吉林、遼寧）使用棉桿而浙江使用麥草等［14］，此外黑木耳生長環(huán)境中的地理經緯度、光照強度、溫度也能影響δ13C值；黑木耳栽培基質中尿素的含量、培養(yǎng)料堆置發(fā)酵中15N的富集致使δ15N值產生差異［14］。本試驗與馬奕顏等［24］利用穩(wěn)定同位素對獼猴桃進行產地溯源以及劉宏艷等［25］利用元素分析儀-穩(wěn)定同位素質譜儀（elementary analysis-isotope tatio mass spectrometers，EA-IRMS）和熱電 離 質 譜 儀（thermal ionization mass spectrometers，TIMS）測定小麥籽粒中的穩(wěn)定同位素組成比值的結論基本一致。δ2H和δ18O是具有地理指示性的穩(wěn)定同位素，不同產地降雨中的δ2H和δ18O值不同，且隨著緯度的增高而貧化，浙江降水充沛、黑木耳基質持水力較強、溫濕度較高，浙江黑木耳δ2H和δ18O值顯著高于東北（黑龍江、吉林、遼寧），符合趙汝婷等［23］和Federica等［26］關于外源水的添加以及氣候和地理位置對δ2H、δ18O值影響較大的結論。不同產地農產品穩(wěn)定同位素δ13C、δ15N、δ2H和δ18O值的差異性在大米［19］、葡萄［27］等農產品上也有體現。

雖然東北（黑龍江、吉林、遼寧）、浙江產地的黑木耳中個別同位素比值存在明顯差異，但不能將兩地黑木耳進行有效區(qū)分，需要再結合PLS-DA法建立兩個產地判別模型，并且將新疆黑木耳作為外部驗證。通過驗證，所建立的判別模型對東北（黑龍江、吉林、遼寧）的產地判別準確率為98.44%，總體判別率達到95.24%，浙江的產地判別準確率為100%，總體判別率達100%。與Chung等［28］和Wang等［29］測定的雙孢蘑菇（R2X=0.822，Q2=0.448）和野生食用菌（96.10%）的準確率相比有所提高。由此說明，此方法和模型可對不同產地的黑木耳產品進行有效判別。為了更好地區(qū)分黑木耳產地，還應考慮黑木耳的實際生產情況，如結合電感耦合等離子體質譜儀（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）和高光譜成像儀（hyperspectral imaging spectrometers，HSI）等測試方法，對不同栽培方式、光照強度、代料配方以及不同季節(jié)、不同潮次的黑木耳進行判別，構建出更加有效和準確的產地判別模型。

4 結論

本研究結果表明，東北（黑龍江、吉林、遼寧）、浙江黑木耳中的δ15N值無顯著差異，浙江黑木耳δ13C值低于東北（黑龍江、吉林、遼寧），δ2H、δ18O值則高于東北（黑龍江、吉林、遼寧），利用PLS-DA判別模型對東北（黑龍江、吉林、遼寧）、浙江黑木耳進行分析，所建立的判別模型對東北（黑龍江、吉林、遼寧）的訓練集判別準確率為98.44%，驗證集判別準確率達到95.24%；而浙江的判別準確率均為100%。結果證明，利用穩(wěn)定同位素技術測定同位素比率并結合PLS-DA法建立的模型可以對東北（黑龍江、吉林、遼寧）和浙江的黑木耳進行有效的產地判別。同時，將穩(wěn)定同位素技術與其他判別技術相結合，應用于黑木耳的產地判別，可進一步完善農產品產地追溯體系。