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        番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAP2的克隆、表達(dá)及功能分析

        2023-01-16 09:59:00
        核農(nóng)學(xué)報(bào) 2023年2期
        關(guān)鍵詞:枯菌青枯病結(jié)構(gòu)域

        陳 娜 邵 勤

        (宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院,江西宜春 336000)

        番茄(Solanum lycopersium)為茄科茄屬一年生或多年生草本植物,在我國(guó)南北各地普遍種植,具有重要的經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。番茄青枯病是由青枯菌引起的一種毀滅性的細(xì)菌性土傳病害,在我國(guó)南方地區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重,每年所造成的番茄減產(chǎn)可達(dá)50%~100%,已成為影響番茄品質(zhì)和產(chǎn)量的重要病害之一[2-3]。因此,加大力度研究番茄對(duì)青枯菌脅迫的響應(yīng)機(jī)制,可為抗青枯病番茄品種的培育提供理論基礎(chǔ)。

        植物在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中為了降低各種生物與非生物逆境對(duì)其的影響,會(huì)進(jìn)化出一套反應(yīng)機(jī)制來(lái)抵御外界脅迫,即通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子與外界信號(hào)和基因調(diào)控相整合的方式產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白和代謝產(chǎn)物來(lái)適應(yīng)脅迫,從而提高植物的抗逆性[4]。NAC轉(zhuǎn)錄因子是近二十年來(lái)發(fā)現(xiàn)的植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族,其名稱由矮牽牛(Petunia hybrida)No Apical Meristem(NAM)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)轉(zhuǎn) 錄 激 活 因 子(ATAF1、ATAF2)和Cup-shaped cotyledon(CUC1/2)三個(gè)基因的首字母縮寫組成[5]。通常NAC蛋白在其N-端含有高度同源且能夠與DNA結(jié)合的NAC結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域由約150個(gè)氨基酸殘基組成,包含5個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域(A、B、C、D、E),其C-端具有轉(zhuǎn)錄激活功能[6]。早期研究表明,NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育[7]、次生壁形成[8]、激素信號(hào)傳導(dǎo)[9]、植株衰老[10]、果實(shí)成熟[11]以及各種非生物[12]和生物[13]脅迫響應(yīng)過(guò)程,并且隨著測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展,越來(lái)越多的NAC轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)掘與鑒定。如Li等[14]研究表明,葡萄(Vitis viniferaL.)VvNAC72通過(guò)抑制乙二醛酶ⅠVvGLYI-4的表達(dá)負(fù)向調(diào)控丙酮醛(methylglyoxal,MG)的解毒作用,并最終通過(guò)水楊酸介導(dǎo)的防御途徑調(diào)節(jié)MG-相關(guān)的活性氧(reactive oxygen species,ROS)穩(wěn)態(tài),增強(qiáng)葡萄對(duì)霜霉病的抗性。目前有研究表明,番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子也參與了植物抗病性的響應(yīng)過(guò)程。Huang等[15]發(fā)現(xiàn)番茄SlNAC1在假單胞菌侵染過(guò)程中表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)。Liu等[16]報(bào)道番茄NAC基因SlSRN1是灰霉病菌(Botrytiscinerea)和丁香假單胞菌[Pseudomonas syringaepv.Tomato(PstDC3000)]防衛(wèi)響應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子。Miao等[17]研究表明,番茄泛素連接酶SINA3(SEVEN IN ABSENTIA3)能夠泛素化一個(gè)防衛(wèi)相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子NAC1,促進(jìn)其降解,并在防衛(wèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。黃瑩[18]在番茄中鑒定到4個(gè)能夠響應(yīng)番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)侵染的NAC轉(zhuǎn)錄因子(SlNAC20、SlNAC24、SlNAC47和SlNAC61),并通過(guò)病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)試驗(yàn)得出,SlNAC61在響應(yīng)TYLCV侵染時(shí)起著正向調(diào)控作用。鄭晨飛[19]研究表明,番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子NAC29在細(xì)菌性葉斑病抗性中具有重要的作用。Wang等[20]報(bào)道,過(guò)表達(dá)番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAP1能夠顯著提高植株對(duì)葉斑病和青枯病的抗性。以上研究均表明,NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的抗病性調(diào)控中扮演著重要角色。但目前關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控青枯病抗性的研究較少,其調(diào)控番茄青枯病的分子機(jī)理仍不清楚。

        前期,宜春學(xué)院蔬菜遺傳育種與分子生物學(xué)課題組通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及表達(dá)譜分析,篩選到一個(gè)表達(dá)差異顯著的NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAP2。本研究以SlNAP2基因?yàn)檠芯繉?duì)象,以番茄高抗青枯病和高感青枯病株系為材料,分析該轉(zhuǎn)錄因子的序列結(jié)構(gòu)以及在不同外源激素和青枯菌脅迫下的表達(dá)模式,通過(guò)VIGS技術(shù)進(jìn)一步對(duì)其參與番茄抗青枯病過(guò)程進(jìn)行分析,旨在為后續(xù)深入研究NAC轉(zhuǎn)錄因子在番茄與青枯病互作中的作用機(jī)理提供參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        植物材料為兩個(gè)番茄自交系株系,高抗青枯病材料Hm 2-2(R),高感青枯病材料BY 1-2(S),由浙南作物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室選育得到。

        番茄青枯菌病原、VIGS載體pTRV1和pTRV2菌株均由江西省作物生長(zhǎng)和發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存,載體圖譜如圖1。

        圖1 pTRV1和pTRV2載體圖譜Fig.1 The map of pTRV1 and pTRV2 vectors

        pMD19-T克隆載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。大腸桿菌(Escherichia coli)感受態(tài)細(xì)胞DH5α和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101均購(gòu)自廣州圍谷潤(rùn)儀器有限公司。

        1.2 番茄SlNAP2基因的克隆

        利用HiPure Total RNA Mini Kit RNA提取試劑盒(Magen,廣州)提取番茄高抗青枯病材料Hm 2-2的總RNA;以HiScript II 1st Stand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme,南京)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA,以該cDNA為模板擴(kuò)增SlNAP2基因序列。運(yùn)用Primer Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物(表1),引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。PCR體系共20μL:10 mmol·L-1正反向引物各1μL,100~200 ng·μL-1模板cDNA 1 μL,2×Taq Master Mix(Vazyme,南京)10 μL,滅菌ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸90 s,30個(gè)循環(huán);72℃終延伸10 min。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),并用Genstar膠回收試劑盒(北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收,最后將回收產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上,用通用引物pMD19-F/R進(jìn)行檢測(cè),挑取陽(yáng)性克隆菌落搖菌,將菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定基因的最終序列。

        表1 引物序列Table 1 Primer sequences

        1.3 番茄SlNAP2基因的生物信息學(xué)分析

        將測(cè)序結(jié)果正確的SlNAP2基因序列通過(guò)NCBI在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)確定該基因的最大開放閱讀框(open reading frame,ORF),同時(shí)將該基因的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列;運(yùn)用NCBI在線程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)對(duì)該基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析;運(yùn)用Clustalw2在線工具(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進(jìn)行同源性比對(duì);運(yùn)用MEGA6軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建;運(yùn)用ProtParam在線程序(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)SlNAP2的蛋白理化性質(zhì);適用Expasy-ProtScale在線程序(https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)SlNAP2的親疏水性;二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)SOPMA在線程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè);三級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)SWISS-MODEL在線程序(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè);使用TMHMM Server v.2.0在線程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)番茄SlNAP2基因編碼的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

        1.4 番茄SlNAP2基因表達(dá)特性分析

        SlNAP2組織特異性基因表達(dá)分析:在番茄長(zhǎng)至五葉時(shí),分別取番茄抗感青枯病材料Hm 2-2和BY 1-2的根、莖、葉片等不同組織進(jìn)行液氮速凍,于-80℃條件下保存,用于后續(xù)總RNA提取。

        SlNAP2在不同處理下的基因表達(dá)分析:待番茄抗感青枯病材料Hm 2-2和BY 1-2長(zhǎng)至五葉時(shí)接種青枯菌病原(1×108CFU·mL-1),同時(shí)進(jìn)行0.2 mmol·L-1水楊酸(salicylic acid,SA)和1.5 mmol·L-1茉 莉 酸 甲 酯(methyl jasmonate,MeJA)激素噴施處理,以清水噴施為對(duì)照。接種青枯菌和噴施激素處理后0、3、6、9 h取樣。所有樣品進(jìn)行液氮速凍,于-80℃條件下保存,用于后續(xù)總RNA提取。

        利用HiPure Total RNA Mini Kit RNA提取試劑盒(Magen,廣州)進(jìn)行總RNA提取;以HiScript II 1st Stand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme,南京)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。以番茄Actin(Solyc03g078400)作為內(nèi)參基因,以StepOne Real-Time PCR儀(Applied Biosystems,Thermo Fisher,美國(guó))進(jìn)行qRT-PCR,檢測(cè)SlNAP2基因在不同組織及不同處理中的相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系20 μL:2×RealStar Green Fast Mixture(with ROX)10μL,上下游引物qSlNAP2F/R(10 mmol·L-1)各0.4μL,cDNA 0.5μL,無(wú)RNase水補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性2 min;95℃變性15 s,60℃退火/延伸20 s,40個(gè)循環(huán);溶解曲線由儀器自動(dòng)設(shè)置。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算SlNAP2基因相對(duì)表達(dá)量[21]。

        1.5 利用VIGS技術(shù)分析番茄SlNAP2基因功能

        在已獲得的SlNAP2基因cDNA序列中,選取ORF非保守區(qū)的約120 bp片段,設(shè)計(jì)引物VSlNAP2-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系和程序同1.2。將VIGS載體pTRV2質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增的回收產(chǎn)物分別用EcoRI和SmaI進(jìn)行酶切37℃2 h,酶切后將所得產(chǎn)物進(jìn)行酶失活70℃15 min,然后用T4連接酶[寶生物工程(大連)有限公司]將載體和PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行連接。連接體系10 μL:pTRV2載體2 μL,PCR回收產(chǎn)物5 μL,350 U·μL-1T4 DNA Ligase 0.5 μL,10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL,ddH2O 0.5 μL、16℃連接過(guò)夜,將連接產(chǎn)物采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞DH5α,構(gòu)建TRV∷SlNAP2重組載體。將pTRV2空載體(TRV∷Empty)及重組載體(TRV∷SlNAP2)分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞GV3101,將pTRV-1菌株分別與TRV∷SlNAP2及TRV∷Empty菌株1∶1(V/V)進(jìn)行混合,注射至番茄抗病材料Hm2-2的葉片中,注射清水為對(duì)照CK。2 d后采用斷根灌根法接種青枯菌,5~7 d后觀察對(duì)照植株與沉默植株的表型,拍照和采樣,具體步驟參照陳娜[22]的方法。提取總RNA,通過(guò)qRT-PCR測(cè)定目的基因SlNAP2的表達(dá)量,反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.4。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 番茄SlNAP2基因的cDNA序列克隆

        以番茄抗青枯病Hm2-2為試驗(yàn)材料,提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板擴(kuò)增SlNAP2序列,得到1 200 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2-A)。切膠回收,將純化后的片段連接至pMD19-T載體上(圖2-B),挑取陽(yáng)性克隆搖菌,將菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果得出SlNAP2的全長(zhǎng)為1 227 bp,大小與圖2-A相符。

        圖2 番茄SlNAP2基因Fig.2 Tomato SlNAP2 gene

        2.2 番茄SlNAP2基因的序列分析

        進(jìn)一步分析番茄SlNAP2基因序列,其ORF為828 bp(圖3),起于175位,止于1 003位,共編碼了275個(gè)氨基酸。在SlNAP2的N-端存在1個(gè)典型的NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域(11~135 aa)(圖4)。

        圖3 SlNAP2 cDNA及預(yù)測(cè)的開放閱讀框Fig.3 Sequences of SlNAP2 cDNA and predicted ORF

        圖4 SlNAP2的保守區(qū)Fig.4 Conservative domain of SlNAP2

        2.3 番茄SlNAP2基因編碼的蛋白同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

        通過(guò)番茄SlNAP2編碼的蛋白與其他物種的同源蛋白序列比對(duì)可知,番茄SlNAP2編碼的蛋白與其他物種的蛋白相似度較高,并且SlNAP2與其他NAC轉(zhuǎn)錄因子一樣,N-端的氨基酸序列保守性很強(qiáng),可進(jìn)一步劃分為A、B、C、D、E 5個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域,C-端高度特異(圖5)。運(yùn)用MEGA6.0軟件對(duì)番茄和其他10種植物的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析,并制作進(jìn)化樹,結(jié)果表明,番茄SlNAP2基因編碼的蛋白與潘那利番茄SpNAP2基因編碼的蛋白同源性最高,其次為馬鈴薯,與毛果楊、橡膠樹等植物的蛋白同源性較低(圖6)。

        圖5 番茄SlNAP2蛋白與其他物種同源蛋白多重序列比對(duì)Fig.5 Multiple alignment of homologous protein for the SlNAP2 in tomato and other species

        圖6 SlNAP2同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of SlNAP2 homologous protein

        2.4 番茄SlNAP2基因編碼的蛋白的生物信息學(xué)分析

        番茄SlNAP2蛋白的理化性質(zhì)用ProtParam在線程序進(jìn)行分析,結(jié)果如表2所示。SlNAP2蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為31 877.23 Da,理論等電點(diǎn)pI為8.56,總負(fù)電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)為31,總正電荷殘基數(shù)(Arg+Lys)為34,其蛋白的分子式為C1423H2187N383O421S15,脂肪系數(shù)為62.69,不穩(wěn)定指數(shù)為24.52,是一種穩(wěn)定蛋白。平均親水指數(shù)為-0.730,同時(shí)運(yùn)用Expasy-ProtScale在線程序分析得出SlNAP2表現(xiàn)出親水性(圖7)。綜上,該蛋白為堿性穩(wěn)定親水性蛋白。

        表2 SlNAP2蛋白的基本理化性質(zhì)Table 2 Basic physical and chemical parameters of SlNAP2 protein

        圖7 SlNAP2蛋白親疏水性分析Fig.7 Hydrophilic analysis of SlNAP2 protein

        2.5 番茄SlNAP2基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜性預(yù)測(cè)

        通過(guò)SOPMA在線程序?qū)lNAP2蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),得出α-螺旋(alpha helix)比例為21.82%,延伸鏈結(jié)構(gòu)(extended strand)的比例為13.09%,β-折疊(beta turn)的比例為3.27%,無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)比例為61.82%(圖8-A)。以上結(jié)果表明該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲所構(gòu)成,延伸鏈結(jié)構(gòu)和β-折疊所占的比例較低。

        為進(jìn)一步了解番茄SlNAP2蛋白的結(jié)構(gòu),利用SWISS-MODEL對(duì)番茄SlNAP2蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的建模分析,結(jié)果如圖8-B所示。SlNAP2蛋白的主要結(jié)構(gòu)是螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲,與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

        圖8 SlNAP2編碼的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 Secondary and tertiary structure prediction of protein encoded by SlNAP2 gene

        使用TMHMM Server v.2.0在線程序?qū)Ψ裇lNAP2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,結(jié)果表明該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖9)。

        圖9 SlNAP2基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.9 Transmembrane structure analysis of protein encoded by SlNAP2 gene

        2.6 SlNAP2基因表達(dá)分析

        2.6.1SlNAP2基因的組織特異性分析對(duì)SlNAP2在番茄不同組織中的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,在番茄抗病材料(R)和感病材料(S)中,SlNAP2均在莖中的表達(dá)量最高,葉中次之,根中最低,并且SlNAP2在抗病材料(R)中的表達(dá)量高于在感病材料(S)中的表達(dá)量(圖10-A)。表明SlNAP2在番茄中的表達(dá)具有組織特異性。

        2.6.2SlNAP2基因?qū)Ψ亚嗫莶∶{迫及SA和MeJA處理的響應(yīng)在番茄五葉時(shí)接種青枯菌,于不同時(shí)間點(diǎn)收集葉片樣品進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)分析,結(jié)果如圖10-B顯示。接種青枯菌后,SlNAP2基因表達(dá)量不斷增加,表明青枯菌能夠誘導(dǎo)SlNAP2基因的表達(dá),并且與番茄青枯菌侵染程度呈正相關(guān)。分別以0.2 mmol·L-1SA和1.5 mmol·L-1MeJA處理番茄植株,檢測(cè)SlNAP2對(duì)外源激素的響應(yīng),結(jié)果顯示,SA處理后,SlNAP2基因的表達(dá)量呈先降后升的趨勢(shì)(圖10-C);MeJA處理后,SlNAP2基因的表達(dá)量呈下降的趨勢(shì)(圖10-D)。推測(cè)SlNAP2可能通過(guò)SA、MeJA通路參與番茄對(duì)青枯菌的脅迫響應(yīng)。

        圖10 番茄SlNAP2基因表達(dá)分析Fig.10 Expression analysis of tomato SlNAP2 gene

        2.7 SlNAP2基因?qū)Ψ亚嗫莶〉目剐哉{(diào)控

        分別提取接種CK、TRV∷Empty和TRV∷SlNAP2后7 d的番茄葉片RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示,與接種清水和空載體TRV∷Empty的植株相比,在TRV介導(dǎo)SlNAP2沉默的抗病植株中,SlNAP2基因表達(dá)量顯著低于CK和TRV∷Empty植株(圖11-A),表明TRV∷SlNAP2接種抗病植株后能有效沉默SlNAP2基因。對(duì)番茄植株的葉片進(jìn)行表型觀察,接種清水和TRV∷Empty植株的葉片沒(méi)有明顯的變化,而接種TRV∷SlNAP2的植株葉片表現(xiàn)出明顯的萎蔫癥狀(圖11-B),表明沉默SlNAP2基因降低了番茄植株對(duì)青枯病的抗性。

        圖11 SlNAP2基因?qū)Ψ亚嗫莶〉目剐哉{(diào)控分析Fig.11 Analysis of SlNAP2 gene regulation of tomato resistance to bacterial wilt

        3 討論

        NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子,也是植物中數(shù)量最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。NAC轉(zhuǎn)錄因子不僅廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控過(guò)程,而且在逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程中扮演著重要的角色,因此研究NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與功能具有重要意義。近年來(lái),隨著全球基因組測(cè)序工作的展開,很多物種的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成。到目前為止,發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)NAC基因家族包含188個(gè)基因[23],蘋果為180個(gè)基因[24],水稻為151個(gè)基因[25],擬南芥為117個(gè)基因[26],毛果楊為120個(gè)基因[27],番茄為104個(gè)基因[28],葡萄為74個(gè)基因[29]。本研究鑒定了番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAP2,并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。序列分析結(jié)果表明,SlNAP2蛋白和其他NAC蛋白一樣,其N-端含有NAM結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域是NAC轉(zhuǎn)錄因子特有的,進(jìn)一步可分為5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域,與大部分前人研究結(jié)果一致[30-31]。通過(guò)對(duì)SlNAP2編碼的蛋白分析結(jié)果可知,該蛋白為親水蛋白,與榮玉萍等[32]研究結(jié)果一致。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知,該蛋白以無(wú)規(guī)則卷曲為主,與譚秦亮等[33]對(duì)菠蘿NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果基本一致。

        前人研究證實(shí)植物抵抗生物脅迫的防衛(wèi)響應(yīng)與外源激素信號(hào)分子有密切的聯(lián)系,如植物激素MeJA和SA是重要的植物抗性分子,在調(diào)節(jié)植物對(duì)生物脅迫的反應(yīng)中扮演著重要角色[34],而NAC轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)節(jié)植物應(yīng)激響應(yīng)的關(guān)鍵因子和植物病原菌防衛(wèi)響應(yīng)的重要因子而得到廣泛關(guān)注。有研究證實(shí),NAC轉(zhuǎn)錄因子能夠通過(guò)植物激素參與植株的生物脅迫響應(yīng)過(guò)程,如水稻NAC轉(zhuǎn)錄因子ONAC122和ONAC131在稻瘟菌(Magnaporthe grisea)侵染后誘導(dǎo)表達(dá),同時(shí)ONAC122和ONAC131能夠被外源激素SA和MeJA所誘導(dǎo),沉默該基因提高了植株對(duì)稻瘟菌的易感性,研究結(jié)果表明ONAC122和ONAC131在水稻抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[35]。Chen等[36]研究表明,茄子SmNAC通過(guò)抑制ICS1(SA合成基因)的表達(dá)來(lái)抑制SA的積累,從而降低植株對(duì)青枯病的抗性。馬鈴薯StNACb4能夠被青枯菌、SA和MeJA所誘導(dǎo),沉默NbNACb4基因可增強(qiáng)煙草對(duì)青枯菌的敏感性,相反過(guò)表達(dá)StNACb4基因則增強(qiáng)了煙草對(duì)青枯菌的耐受性,表明StNACb4在馬鈴薯抗青枯病脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[37]。本研究通過(guò)探究青枯菌和SA、MeJA激素脅迫下SlNAP2在番茄抗感材料中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn),該基因?qū)η嗫菥?、茉莉酸甲酯和水楊酸脅迫處理均有不同程度的響應(yīng),表明SlNAP2確實(shí)參與響應(yīng)青枯菌生物脅迫和激素脅迫。其中SA誘導(dǎo)的SlNAP2的表達(dá)趨勢(shì)與青枯菌誘導(dǎo)的變化趨勢(shì)相似,推測(cè)SlNAP2可能通過(guò)SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與番茄對(duì)青枯菌的脅迫響應(yīng)。

        前人研究證實(shí)NAC轉(zhuǎn)錄因子參與了番茄生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程,如在煙草中過(guò)表達(dá)番茄SlNAC35能夠增強(qiáng)植株對(duì)細(xì)菌性病原菌的抗性[38];番茄轉(zhuǎn)錄因子NAC29在細(xì)菌性葉斑病抗性中具有重要作用[19];番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子NAC089是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的免疫(endoplasmic reticulum stress-mediated immunity,ERSI)和植物對(duì)病原體抗性所必需的[39]。本研究發(fā)現(xiàn),在番茄中利用VIGS技術(shù)沉默SlNAP2之后接種青枯菌病原,番茄抗病材料的葉片表現(xiàn)出萎蔫癥狀,說(shuō)明SlNAP2在番茄對(duì)青枯病的抗性中發(fā)揮著正調(diào)控作用。本研究結(jié)果證實(shí)了NAC轉(zhuǎn)錄因子在番茄生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中的作用,但其調(diào)控番茄青枯病的分子機(jī)理仍未清楚,今后可進(jìn)一步進(jìn)行SlNAP2與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因的互作分析,并可開展SlNAP2與青枯菌病原無(wú)毒或致病基因相關(guān)蛋白互作研究,從而明確番茄SlNAP2轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控青枯病,對(duì)SlNAP2的調(diào)控機(jī)理進(jìn)行深入的分析。這對(duì)培育持久、廣譜抗性的番茄品種具有重要的理論和實(shí)踐意義。

        4 結(jié)論

        本研究從番茄中克隆得到一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAP2,全長(zhǎng)1 227 bp,編碼275個(gè)氨基酸,為堿性穩(wěn)定親水性蛋白,且與潘那利番茄SpNAP2親緣關(guān)系最近。qRT-PCR分析結(jié)果表明,SlNAP2基因的表達(dá)具有組織特異性,同時(shí)番茄SlNAP2基因可受到青枯菌、水楊酸和茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)。進(jìn)一步利用VIGS技術(shù)沉默SlNAP2后接種青枯菌,番茄植株對(duì)青枯病的抗性降低,表明SlNAP2在番茄抗青枯病過(guò)程中起正調(diào)控作用。

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