王曉臻，王曉雯，王 乙，王倩倩，曹亦菲

(杭州師范大學 公共衛(wèi)生學院，浙江 杭州 311121)

砷廣泛分布在自然界的土壤和礦藏中，是一種類金屬物質，也是公認的致癌物。人類長期暴露于砷會導致肺癌、膀胱癌和皮膚癌等癌癥，還會導致心血管疾病、腸胃炎、糖尿病、生殖疾病和外周神經病變等疾病[1-2]。雖然砷具有毒性，但砷化合物被用作藥物治療疾病在東西方已有千年歷史[3]。

水-甘油通道蛋白(aquaglyceroporins, AQPs)是轉運水、甘油和二氧化碳等小分子的特異性通道蛋白，砷進入機體的主要方式為通過AQPs進出細胞。本文討論AQPs在砷運輸中的作用、AQPs與p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)的相互關系，以及對各種人類疾病的功能影響。

1 水-甘油通道蛋白作為類金屬轉運蛋白

水-甘油通道蛋白是主要內在蛋白(major intrinsic protein，MIP)超家族的成員，水、甘油、二氧化碳和尿素等小分子溶質可以借助該家族蛋白在細胞間轉運。MIP超家族有三個亞家族：水通道蛋白，水-甘油通道蛋白和超水通道蛋白[4-5]。其中AQPs在大多數(shù)生物中廣泛存在[6]，在原核生物、真核生物和哺乳動物中皆有發(fā)現(xiàn)。有研究顯示，將砷作用于小鼠的不同組織中，AQPs mRNA在小鼠的食道、腎臟、心臟和肝組織的表達水平都有明顯升高[7]。AQPs主要負責三價砷進入細胞[8]。亞砷酸鹽[As(Ⅲ)]和砷酸鹽[As(Ⅴ)]是砷的兩種重要的氧化形態(tài)，As(Ⅴ)的毒性遠小于As(Ⅲ)。As(Ⅴ)在溶液中，以氧陰離子的形式存在，它的性質與磷酸鹽類似，是許多酶的競爭性抑制劑。一般情況下，當細胞內磷酸鹽水平足夠高時，As(Ⅴ)不會直接引起砷毒性。而As(Ⅲ)則以As(OH)3的形式在溶液中存在，其性質類似于甘油，是一種無機多元醇，又因為AQPs是一種雙向通道，它的孔隙可以讓甘油等分子通過，因此，As(Ⅲ)可以通過AQPs進入細胞[9]。

2 砷在生物體中的運輸

2.1 砷在原核生物中的運輸 1972年，Richey等[10]證明水-甘油通道蛋白(glycerol facilitator protein,GlpF)可以促進甘油的擴散。1997年，Barry P. Rosen團隊[11]首次發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中，As(Ⅲ)可以通過GlpF進入細胞。2004年，該團隊在缺失砷抗性操縱子arsRBC的AW3110大腸桿菌和利用轉位子TnphoA插入glpF基因建立的OSBR1突變體中，觀察As(Ⅲ)的吸收率，結果發(fā)現(xiàn)破壞glpF基因會大大降低As(Ⅲ)的吸收率[12]，這表明GlpF是As(Ⅲ)進入細胞的主要吸收途徑。水-甘油通道蛋白還可與其他蛋白合作產生累加效應。2008年，Singh等[13]在一種名為墨角藻的耐砷海藻中鑒定出一種砷螯合金屬硫蛋白(arsenic-chelating metallothionein，fMT)，在大腸桿菌中表達fMT時，fMT和GlpF在一起可以增加亞砷酸鹽的吸收。同時AQPs也是砷的一種外排途徑。豆科植物共生體苜蓿中華根瘤菌會利用水-甘油通道蛋白(AqpS，GlpF同系物)作為砷的解毒途徑[14]。研究表明，當苜蓿根瘤菌暴露于As(Ⅴ)環(huán)境時，As(Ⅴ)通過磷酸鹽轉運系統(tǒng)進入細胞，并被砷酸鹽還原酶ArsC還原為As(Ⅲ)，然后通過AqpS沿著濃度梯度流出細胞[15]。同樣，甲基亞砷酸鹽[Mas(Ⅲ)]也可通過AqpS沿著濃度梯度流入苜蓿細胞，在那里被抗Mas(Ⅲ)蛋白ArsH氧化成甲基砷酸鹽Mas(Ⅴ)，然后Mas(Ⅴ)也通過AqpS沿著濃度梯度流出細胞，是Mas(Ⅲ)的解毒途徑[15]。

因此，在原核生物中，水-甘油通道蛋白既可以吸收As(Ⅲ)，也可以外排As(Ⅲ)。如圖1所示，在大腸桿菌和苜蓿根瘤菌中，砷酸鹽都是由磷酸鹽轉運體帶入細胞的[9]。大腸桿菌arsRDABC操縱子編碼的砷伴侶蛋白ArsD與As(Ⅲ)的外排泵蛋白ArsA之間的交互作用，可以在較低的亞砷酸鹽濃度下提高其ATPase活性，提高As(Ⅲ)的排出速率[16]。Mas(Ⅲ)通過AqpS沿著濃度梯度流入苜蓿細胞，被抗Mas(Ⅲ)蛋白ArsH氧化成甲基砷酸鹽Mas(Ⅴ)，然后Mas(Ⅴ)通過AqpS沿著濃度梯度流出細胞。

圖1 砷在大腸桿菌和苜蓿中華根瘤菌的進入和流出途徑

2.2 砷在真核生物中的運輸 2001年，Wysocki等[17]首次發(fā)現(xiàn)釀酒酵母FPS1基因編碼的水-甘油通道蛋白Fps1p可以介導As(Ⅲ)的攝取，F(xiàn)PS1基因的缺失可提高對As(Ⅲ)的耐受性。Fps1p通道組成性表達的細胞對砷高度敏感。在高滲透壓條件下，當Fps1p通道關閉時，野生型細胞顯示出與fps1Δ突變體(缺失FPS1基因)同等程度對As(Ⅲ)的耐受性。因此，F(xiàn)ps1p介導的通路參與酵母中類金屬的吸收。在進一步的研究中，Maciaszczyk等[18]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入As(Ⅲ)后，為了阻止細胞吸收As(Ⅲ)，F(xiàn)PS1基因早期的表達會下調，但當砷中毒持續(xù)存在時，它的表達反而會再次增加，F(xiàn)ps1p與亞砷酸鹽轉運蛋白Acr3p協(xié)同調節(jié)排出As(Ⅲ)。這表明Fps1p在砷的解毒中也起著生理作用。另外在酵母水通道蛋白無效突變體和非洲爪蟾卵母細胞的異源系統(tǒng)中表達了三種已知的布氏錐蟲水-甘油通道蛋白(TbAQPs)，發(fā)現(xiàn)這兩種表達系統(tǒng)中，三種TbAQPs在合適的PH下都介導了As(Ⅲ)在細胞內的攝入和排出[19]，表明TbAQPs也是砷進出細胞的通道之一。

在哺乳動物中，1993年，Agre等[20]首次從紅細胞膜上發(fā)現(xiàn)了AQP1，直到目前，已發(fā)現(xiàn)13個水通道蛋白(AQP)[21]。其中水-甘油通道蛋白主要有AQP3、AQP7、AQP9和AQP10。2002年，Liu等[22]發(fā)現(xiàn)非洲爪蟾卵母細胞顯微注射AQP7或AQP9 cRNA探針后，73As(Ⅲ)轉運增加。這些結果表明，AQP9和AQP7可能是哺乳動物細胞攝取As(Ⅲ)的主要途徑。2004年，Liu等[23]進一步發(fā)現(xiàn)AQP7和AQP9在釀酒酵母和卵母細胞中表達時可以轉運73As(Ⅲ)，并且AQP9似乎是As(Ⅲ)最有效的轉運體。在具體的動物實驗中，王春等[24]使用SPF級雄性ICR小鼠研究三價砷在小鼠胃腸道中的轉運與AQPs表達的關系，發(fā)現(xiàn)胃腸組織均表達AQP3，胃組織表達水平最高，AQP9在胃組織中也表達，小腸組織表達AQP7，給予AQPs抑制劑后能抑制小鼠胃腸組織吸收砷，提示AQPs與砷在胃腸道的生物轉運有關。Hamdi等[25]從斑馬魚cDNA中克隆了5個與人AQP3，AQP9和AQP10同源的基因，將它們命名為aqps。在砷的刺激下，檢測到它們在斑馬魚多個器官中表達，表明aqps是斑馬魚中砷攝入的主要途徑。本團隊之前的研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細胞中，砷能調節(jié)AQP9的表達和磷酸化水平，表明AQP9也是哺乳動物細胞中砷攝入的主要途徑[26]。

2.3 p38 MAPK蛋白激酶對AQP9表達和砷運輸?shù)挠绊?AQP9是主要的肝臟水-甘油通道蛋白，它同時傳導無機As(Ⅲ)和有機單甲基亞砷酸[MMA(Ⅲ)]，MMA(Ⅲ)是細胞甲基化過程中產生的中間產物。已證明AQP9是一種參與砷吸收的跨膜蛋白[8]，它可能在無機As(Ⅲ)從血液流入肝臟和As代謝物MMA(Ⅲ)從肝臟流出到血液的過程中發(fā)揮重要作用[27]。過量表達AQP9能提高肝癌細胞的增殖抑制率和凋亡率，抑制AQP9表達則相反[28]。2012年，有研究首次報道利什曼原蟲水-甘油通道蛋白的活性受MAPK蛋白激酶的調節(jié)[29]。不同的AQP可以由不同的MAPKs信號轉導途徑調節(jié)。Yang等[30]研究表明，砷刺激增加了大鼠星形膠質細胞中的AQP3、-4、-5、-8和-9的表達，細胞外調節(jié)蛋白激酶抑制劑可減弱砷暴露后AQP3、-5和-8的表達，而p38 MAPK蛋白激酶抑制劑抑制了AQP4和AQP9的表達。鄧盧翠等[31]的研究顯示，p38 MAPK在正常肝細胞L-02中對AQP9磷酸化有一定的調控作用。這表明調節(jié)MAPKs活性將影響AQP的表達，p38 MAPK與AQP4和AQP9的表達有關聯(lián)。2013年，Johnson等[32]通過篩選釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的全套基因缺失突變體，發(fā)現(xiàn)了75個對As(Ⅲ)敏感的突變體和39個對As(Ⅲ)抗性突變體。他們首次將轉錄因子yap3p與細胞對As(Ⅲ)的解毒作用聯(lián)系在一起，證實Hog1p MAPK通路在抗砷中毒的作用[32]，Maciaszczyk等[18]也發(fā)現(xiàn)蛋白激酶Hog1p可以使釀酒酵母中的Fps1p下調從而減少As(Ⅲ)的攝取。還有研究發(fā)現(xiàn)p38 MAPK在砷誘導細胞凋亡時期具有抑制作用，但也有研究顯示當p38 MAPK受到砷刺激時，表達量也會增高，加速細胞凋亡[33]。以上研究表明p38 MAPK的表達在抗砷毒性的過程中，可能與AQP9的表達關聯(lián)緊密，但目前相關方面的研究未見較多報道，還有待深入。對于砷誘導細胞凋亡的機制，p38 MAPK的作用也仍有爭議。

3 水甘油通道蛋白與砷運輸對人類疾病的影響

砷作為藥物已經有悠久的歷史。As2O3現(xiàn)在常被用作治療急性早幼粒細胞白血病(APL)。2004年，Bhattacharjee等[34]首次發(fā)現(xiàn)AQP9可以調節(jié)人白血病細胞的藥物敏感性，低劑量的As2O3與維生素D聯(lián)合使用，與避免毒性的化療方案一樣有效。他們用維生素D對HL60細胞進行預處理，結果顯示AQP9的表達較高，并且對As(Ⅲ)和Sb(Ⅲ)有超敏性。這種敏感性歸因于隨著AQP9藥物吸收系統(tǒng)表達的增加，三價類金屬的吸收率增高。同樣，Iriyama等[35]發(fā)現(xiàn)過表達AQP9后，肝癌細胞的增殖抑制率和凋亡率高于單純As2O3組，抑制AQP9表達則相反，提示AQP9的表達增多，可增強某些腫瘤細胞對As2O3化療的敏感性。這與唐潔[28]的研究結果一致。

全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)和三氧化二砷(ATO)是治療APL的有效誘導療法。由于APL治療期間，早期血栓出血并發(fā)癥和死亡率仍然很高，為了研究ATRA啟動時間和ATO的納入對患者預后的影響，一項2000—2017年期間接受APL治療的所有患者臨床記錄的回顧性研究顯示，早期運用ATRA治療降低了APL患者的早期不良事件，ATO的加入有助于進一步改善APL的早期和晚期預后，結果顯示ATRA和As2O3之間可能存在著協(xié)同作用[36]。Leung等[37]研究表明，ATRA預處理髓系白血病細胞株HL-60后，可上調AQP9，顯著增加砷吸收。但也有研究發(fā)現(xiàn)AQP1和AQP5是一些腫瘤增殖的參與蛋白，會減少砷類化合物在腫瘤灶內的積蓄程度[38]。

除了治療白血病，三氧化二砷也可以聯(lián)合其他化療藥物、激素類藥物等治療其他腫瘤疾病。一項研究哺乳動物砷轉運蛋白AQPs和葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)在1型糖尿病(T1DM)小鼠中的表達研究表明，AQPs的表達受胰島素水平的調節(jié)，在糖尿病模型中，胰島素降低了肝臟和大腦中AQP9基因的表達，T1DM可能增加了三價無機砷轉運蛋白的表達，從而增加了特定組織對砷的攝取[39]。因此，了解含砷藥物的作用機制及與各類藥物的聯(lián)合作用機制，闡明藥物輸導的途徑及其調節(jié)因子非常重要。

4 小結

目前，大量研究均表明砷劑能夠應用于臨床治療多種疾病，且具有較好的療效。AQPs的功能與砷在人體的代謝過程密切相關，了解AQPs與砷之間的作用機制對研究如何使用砷劑對疾病進行靶向治療具有重要意義。然而同砷既具毒性又具藥性的性質類似，在一定的條件下，AQPs協(xié)助砷出入細胞，既可以發(fā)揮砷治療疾病的特性，也可能會增加砷毒性在機體的累積而引起砷相關疾病。AQP在饑餓狀態(tài)下與肝細胞的糖異生水平有關，在饑餓狀態(tài)下，AQP9的表達會增加[40]，因此，在營養(yǎng)不良時攝入砷會增加發(fā)生肝砷中毒的可能[41]。Sumi等[7]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠腹腔注射As(Ⅲ)后，食道是砷高度積累的器官，其中AQP3高表達、mrp2抗體低表達、谷胱甘肽合成能力低和Nrf2通路激活少都可能增加了砷暴露對食道功能產生不利影響的可能性[7]。p38 MAPK信號通路等調節(jié)因子對AQPs的表達和砷對機體作用之間的相關機制也還具有爭議。因此，研究在砷轉運中起重要作用的AQPs以及多種信號通路和調節(jié)因子的相互作用機制，對研究砷的毒作用機制及藥用機制可以提供重要的依據(jù)，AQPs與p38 MAPK信號通路和砷之間的相互作用的研究也是我們繼續(xù)深入研究的方向。