吳國明，張 盈，王 楠

(1.浙江中醫(yī)藥大學附屬江南醫(yī)院 骨科，浙江 杭州 311201；2.蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院 婦科，浙江 杭州 311201)

臨床常見因各種外傷所致的肌腱損傷[1-2]，肌腱損傷在自我修復過程中可能會造成粘連。嚴重肌腱損傷一般需要手術(shù)治療，而手術(shù)治療可能繼發(fā)的粘連性更大，并會嚴重影響關(guān)節(jié)功能。因此，如何防止肌腱損傷修復過程中的粘連是臨床上迫切需要解決的科學問題。成纖維細胞的增殖是肌腱損傷修復過程中形成粘連的重要因素[3]。可抑制成纖維細胞增殖的藥物主要有5-氟尿嘧啶(5-Fu)、6-磷酸果糖等[3]，但局部給藥后，上述藥物很快就會泄露至機體循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)，造成局部的藥物有效濃度過度降低。因此，為維持肌腱局部治療的有效藥物濃度水平，需要頻繁給藥，不僅提高了藥物的毒副作用，而且增加肝腎負擔，從而降低了患者的依從性。為此，我們制備了5-Fu的緩釋劑型(即負載5-Fu的PLGA微球)，觀察其對體外培養(yǎng)的大鼠肌腱成纖維細胞的抑制作用，從而為確證5-Fu的新型緩釋劑是否能有效調(diào)節(jié)和預防術(shù)后肌腱的粘連提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備 冷凍干燥機(FD-1A-50，上海)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-501，山東)，勻漿機(S10，上海)。

1.2 主要藥品與試劑 5-氟尿嘧啶(5-FU)(美國Sigma-Aldrich公司)；聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid，PLGA)(貨號：P133293，阿拉丁公司)；明膠(貨號：G108398，阿拉丁公司)及二氯甲烷(貨號：G1238N，西隴化工股份有限公司)。

1.3 細胞、生化試劑及抗體 大鼠成纖維細胞系(RAT-1)由本院實驗室保存。完全培養(yǎng)基：DMEM 90%；胎牛血清10%(Thermo Fisher Scientific，貨號:11965092)。培養(yǎng)條件：37 ℃，5%二氧化碳。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基及胎牛血清購自Thermo Fisher公司。PVDF膜購自Millipore公司(Thermo Fisher Scientific，貨號：88518)。CCK-8試劑盒(用于細胞增殖分析)購自日本同仁化學研究所(Dojindo，貨號：39580)。ROS檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所(貨號：S00335)。AKT(Abcam,貨號：6532)、p-AKT(貨號：3420)、Bax(貨號：2898)、Bcl-2(貨號：3689)、GAPDH(貨號：8924)抗體，均購自美國Cell Signaling Technology(Danvers，Mass)。EdU試劑盒購自銳博生物科技有限公司。ANNEXINV-FITC/PI購自北京索萊寶公司(貨號：589214)。

1.4 PLGA微球制備 配制明膠溶液備用。采用復乳溶劑蒸發(fā)法，將200 mg PLGA溶解在2 mL二氯甲烷溶液中，將20 mg 5-氟尿嘧啶加入上述溶液中做為油相，充分溶解后加入到10 mL的2%明膠溶液中，用手持式勻漿機在10 000 r/min高速攪拌60 s，形成初乳溶液；迅速將初乳溶液倒入100 mL的0.5%PVA中，冰浴下10 000 r/min攪拌10 s，形成復乳溶液;將復乳溶液倒入500 mL的0.5%明膠溶液中，室溫下磁力攪拌2 h,減壓蒸餾6 h去除其中殘余的有機溶劑，10 000 r/min離心10 min，去離子水洗3次，將沉淀冷凍干燥可得到PLGA微球載5-氟尿嘧啶粉末，4 ℃保存。

1.5 Western-blot分析 5-Fu-PLGA微球處理RAT-1成纖維細胞后，采用Western-blot檢測胞內(nèi)信號分子(AKT、mTOR)、增殖相關(guān)基因蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Survivin)、凋亡相關(guān)基因蛋白(Bax、Bim)的表達水平，操作過程嚴格按照說明書進行。使用伯樂ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)觀察熒光條帶。

1.6 DCFH-DA熒光檢測成纖維細胞活性氧含量 將成纖維細胞(RAT-1)密度調(diào)整為2×105/mL，然后，將細胞接種于6孔板中，再將5-Fu-PLGA微球加入培養(yǎng)液中，并繼續(xù)培48 h洗滌細胞后加入DCFH-DA(實驗步驟按照說明書操作指南)。37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵2 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 CCK-8檢測RAT-1細胞增殖能力 將RAT-1細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后將細胞以4×105每孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每個處理組至少設(shè)立3個重復孔，將細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞完全貼壁后,分別加入5-氟尿嘧啶的PLGA微球，并培養(yǎng)至不同的時間節(jié)點后,將CCK-8檢測溶液加入并在37 ℃條件下繼續(xù)孵育3.5 h，使用酶標儀(450 nm)檢測每孔的吸光度。

1.8 細胞凋亡的檢測 使用5-Fu-PLGA微球刺激纖維細胞(RAT-1)，洗滌2次后，使用ANNEXINV-FITC/PI檢測試劑盒檢測成纖維細胞的凋亡情況。實驗過程嚴格參照索萊寶的試劑盒進行。

2 結(jié)果

2.1 5-Fu-PLGA微球制備成功 按照上述的技術(shù)方法，成功制備5-Fu-PLGA微球，見封三圖1。掃描電鏡觀察可見微球呈正圓形，粒徑約為20 μm左右，形態(tài)規(guī)整。

2.2 5-Fu-PLGA微球?qū)Τ衫w維細胞增殖的影響 分別使用1、5、10、20 mg的PLGA微球處理成纖維細胞24～72 h后，經(jīng)CCK-8檢測，結(jié)果顯示：不 同濃度的5-氟尿嘧啶的PLGA微球能夠以劑量依賴性的方式抑制成纖維細胞的增殖。見圖1。

圖1 5-Fu-PLGA微球抑制成纖維細胞的增殖

2.3 5-Fu-PLGA微球?qū)ο嚓P(guān)蛋白的影響 Western-blot檢測結(jié)果顯示，5-Fu-PLGA微球處理成纖維細胞后，AKT、Juk、mTOR及Bcl-2、Bcl-xL、Survivin的表達水平低于對照組，Bax、Bim的表達水平高于對照組(PLGA微球)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但在磷酸化的ERK1/2和p38MAPK表達中未觀察到明顯影響(P>0.05)。見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.4 5-Fu-PLGA微球誘導成纖維細胞氧化應(yīng)激 單純處理PLGA微球的成纖維細胞(對照組)內(nèi) ROS含量，高于5-Fu-PLGA微球處理的成纖維細胞內(nèi) ROS含量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見封三圖2。

2.5 EdU檢測5-Fu-PLGA微球?qū)Τ衫w維細胞增殖的影響 細胞增殖EdU檢測結(jié)果顯示，5-Fu-PLGA微球組熒光細胞陽性率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.6 5-氟尿嘧啶的PLGA微球成纖維細胞凋亡的影響 Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測分析5-Fu-PLGA微球?qū)Τ衫w維細胞凋亡的影響，結(jié)果表明，與對照組相比，PLGA 5-Fu-PLGA微球引起細胞凋亡的比例顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見封三圖3。

3 討論

肌腱損傷在自我修復過程中可能會造成粘連，嚴重者可能會影響關(guān)節(jié)功能。因此，如何預防肌腱損傷修復過程中的粘連是一個亟待解決的臨床問題[1]。以往研究表明,引起肌腱形成粘連的因素主要包括：1) 來源于周圍組織的成纖維細胞向肌腱斷開方向增殖生長，這是引起粘連最核心的因素之一；2) 炎癥也是造成肌腱粘連的因素之一；3) 受傷后，肌腱細胞的自我增殖修復可能會與周圍組織的成纖維細胞密切相關(guān)，進而可能引發(fā)粘連。因此，在肌腱損傷修復過程中抑制成纖維細胞的增殖，是解決肌腱粘連的方法之一。5-氟尿嘧啶雖能夠抑制成纖維細胞的增殖，但由于其藥物本身的特性，給藥后的5-氟尿嘧啶會發(fā)生泄露至循環(huán)系統(tǒng)的現(xiàn)象，引起藥物濃度迅速降低。PLGA是一種高分子聚合物材料，由于PLGA擁有良好的生物可降解性能，因此PLGA已被廣泛用作緩控釋系統(tǒng)的骨架材料，并已經(jīng)有以PLGA為載體的藥品上市[3-4]。 本研究中，我們使用PLGA作5-氟尿嘧啶載體材料，研制了5-Fu-PLGA微球緩釋劑。通過這種緩釋、控釋的給藥方式，可以在較長的一段時間內(nèi)持續(xù)釋藥，維持藥物的有效治療濃度，避免局部高藥物濃度引起的刺激作用。

本研究中，我們首先使用成纖維細胞模型在體外評估5-Fu-PLGA微球緩釋劑的潛在生物活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：5-氟尿嘧啶的PLGA微球緩釋劑能夠抑制成纖維細胞的增殖，抑制AKT和mTOR信號通路的活化；可以抑制抗凋亡基因Bcl-2，Bcl-xL和Survivin的表達，并增加了凋亡基因Bax及Bim的表達；但對ERK1/2和p38MAPK信號通路的激活沒有顯著的影響；進一步分析還發(fā)現(xiàn)5-Fu-PLGA微球可以顯著提高ROS的水平，促進成纖維細胞的凋亡。

5-氟尿嘧啶(5-Fu)屬于抗代謝類的藥物，能干擾DNA的合成進而抑制細胞的增殖，臨床上主要用于治療腫瘤。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)5-Fu可明顯降低肌腱周圍組織中成纖維細胞的含量。他們將5-Fu應(yīng)用于兔肌腱局部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-Fu可顯著降低受損肌腱細胞的增殖，并能有效提高肌腱術(shù)后的功能恢復[5-6]。研究表明,不同濃度的5-Fu溶液作用于雞的肌腱斷端，發(fā)現(xiàn)其能顯著降低術(shù)后肌腱粘連的程度。但由于5-Fu在體內(nèi)的半衰期非常短，只有10～20 min，這在很大程度上限制了5-Fu在治療中的具體應(yīng)用[5]。PLGA具有出色的生物相容性和可生物降解性，微球緩釋給藥可延長5-Fu的半衰期。席寧等[7]制備了姜黃素的PLGA納米微球，并發(fā)現(xiàn)其具有良好的緩釋特性。此外，劉梓昕等[8]全面地綜述了PLGA微球的抗腫瘤作用。為了提高5-Fu的應(yīng)用潛力，我們在總結(jié)一系列前人研究的基礎(chǔ)上，使用PLGA作為5-氟尿嘧啶載體材料，研制了負載5-Fu的PLGA微球緩釋劑，并通過一系列的實驗驗證了其生物活性。因此，負載5-Fu的PLGA微球作為緩釋劑型用于防治肌腱粘連具有廣闊的前景[9-10]。

綜上，5-氟尿嘧啶的PLGA微球緩釋劑具有良好的生物學性能，能夠顯著抑制成纖維細胞的增殖，促進成纖維細胞凋亡，這為其進一步在體內(nèi)進行相關(guān)的臨床試驗奠定了良好的基礎(chǔ)。