徐存來，曹 卓,，尹章勇 ，陳 璇 ，李雨玲 ，龔易莎 ，蔣奕薇 ，潘炯偉

(1.麗水市人民醫(yī)院 呼吸與危重癥科，浙江 麗水 323000；2.溫州醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，浙江 溫州 325035)

癌癥篩查的目的就是盡量在沒有任何癥狀的情況下，通過各類檢測手段，包括但不限于血液學檢查和影像學檢查，來發(fā)現(xiàn)潛在的腫瘤或疾病。如何準確地發(fā)現(xiàn)早期肺癌并進行干預是預防肺癌主要的任務之一。與胸部X線相比，低劑量計算機斷層掃描可以將肺癌死亡率降低20%以上[1]。然而，每天用肉眼篩選大量CT圖像對于放射科醫(yī)師來說是巨大的壓力，且單純的影像學篩查早期肺癌準確性和特異性仍需提高[1]。近年來發(fā)展起來的人工智能信息挖掘技術(shù)，在解決大量數(shù)據(jù)帶來的多參數(shù)統(tǒng)計分析問題上具有獨到的優(yōu)勢，因此，利用掌握的涉及不同機制的分子生物標志，同時聯(lián)合影像學數(shù)據(jù)建立的數(shù)據(jù)分類模型，將對提高肺癌的早期判別準確率有巨大的促進作用。為此，本文擬以基于靶掃描的3D卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(3D-CNN)技術(shù)聯(lián)合基因檢測建立模型并運用于早期肺癌篩查。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為前瞻性巢式病例對照研究。選取2017年12月—2020年12月經(jīng)麗水市人民醫(yī)院府前院區(qū)呼吸與危重癥科因“肺結(jié)節(jié)”入院患者作為研究隊列，收集其基線數(shù)據(jù)、外周血及CT影像學，并隨訪90天。隊列中經(jīng)手術(shù)病理活檢確診的Ⅰ/Ⅱ期非小細胞肺癌患者80例作為肺癌組，術(shù)前未經(jīng)任何抗癌治療、無職業(yè)致癌物接觸史。選取隊列中和病例組同一個月在我科經(jīng)手術(shù)病理活檢確診為感染性病變且無腫瘤病史的肺結(jié)節(jié)患者80例作為良性組。兩組的年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理學委員會批準，研究對象均知情同意。

1.2 DNA提取及甲基化檢測 所有研究對象均入組次日抽取空腹外周靜脈血樣本2 mL，置于4 ℃保存不超過1周，在新鮮狀態(tài)下提取DNA備用，選擇受試者外周血中pl6、RASSFIA基因啟動子區(qū)甲基化水平作為觀察指標，嚴格按照說明書操作。主要試劑：DNA提取試劑盒(TIANamp)，人類DNA甲基化試劑盒(Zymo Research)，人類基因組甲基化p16和RASSF1A基因檢測試劑盒(上海透景)。p16基因：上游引物 5′-GAAGAAAGAGGAGGGGCTG-3′，下游引物 5′-GCGCTACCTGATTCCAATTC-3′；RASSF1A基因：上游引物5′-GGGTTTTGCGAGAGCGCG-3′，下游引物 5′-GCTAACAAACGCGAACCG-3′?；驍U增條件：Taq 酶0.5 μL，模板DNA 2.5 ng，上游引物(20 μmol/L)1 μL，下游引物(20 μmol/L)1 μL，GC buffer125 μL，dNTP(含Mg2+)8 μL，滅菌蒸餾水加至50 μL。PCR反應條件：95 ℃熱啟動15 min；95 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃8 min。

1.3 影像學處理 所有入組對象進行常規(guī)的低劑量CT掃描，加上我院的人工智能系統(tǒng)(飛圖智能軟件)，發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)后進行靶掃描+二三維度重建，靶掃描采用較高劑量進行掃描(120 kV，408 mA)，且針對病灶部位進行掃描，執(zhí)行ROI重建并且圖像重建大小為1 024×1 024，層厚為1 mm，層數(shù)為56層。參與的讀片醫(yī)師均為高年資醫(yī)師，由3人以上一起讀片。

1.4 Fisher判別分析 Fisher判別分析模型的基本思想是先投影后判別。投影是指將原來的P維(X空間)的輸入變量投影到K維(Y空間)上。本文按3∶1的比例將數(shù)據(jù)隨機分成訓練集和預測集兩組，在SPSS Modeler 18.0中實現(xiàn)。

1.5 C5.0決策樹模型 決策樹最上面的節(jié)點是根節(jié)點，從上到下每個節(jié)點都會遇到一次測試，不同的測試結(jié)果會輸出不同的分支。其在SPSS Modeler 18.0中實現(xiàn)對整理好的數(shù)據(jù)建立預測模型。

1.6 3D-CNN方法 以患者靶掃描的圖像作為數(shù)據(jù)來源，由3名高年資影像醫(yī)師進行標注，選擇最能夠體現(xiàn)肺結(jié)節(jié)特征的3層圖像。針對每一個具有金標準的病灶，用矩形框標注出病灶的每一層結(jié)構(gòu)。其中，肺癌設置標簽為1，肺良性病變設置標簽為2。160例數(shù)據(jù)里面總共標注了80個肺癌結(jié)節(jié)和80個肺良性病變結(jié)節(jié)。本課題組按5∶3的比例將數(shù)據(jù)隨機分成訓練集和預測集兩組，在SPSS Modeler 18.0中實現(xiàn)。研究采用神經(jīng)網(wǎng)絡算法，在SPSS Modeler 18.0軟件中參數(shù)如下：使用分割數(shù)據(jù)=否；方法=Quick；避免過度訓練=50%；設置隨機種子數(shù)=否；按條件停止=Times1 min；優(yōu)化=memory；繼續(xù)訓練存在的模型=否；使用二進制元集合編碼=是；顯示反饋圖=是。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0軟件處理數(shù)據(jù)。2組pl6和RASSFIA基因甲基化比較采用Z檢驗，基于靶掃描的3D-CNN網(wǎng)絡模型分類結(jié)果采用直接卡方檢驗。設定的檢驗水準為0.05。

2 結(jié)果

2.1 甲基化檢測 肺癌組外周血pl6、RASSFIA基因啟動子甲基化水平均高于良性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 外周血肺癌組和良性組pl6和RASSFIA基因甲基化比較

2.2 基于靶掃描的3D-CNN網(wǎng)絡模型分類 采用3D-CNN網(wǎng)絡模型后，預測集分類準確率(83.33%)比訓練集(72.00%)提高，但二者差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.602，P=0.438)。

2.3 預測模型的診斷效果 從Fisher、決策樹、3D-CNN模型對預測集的診斷結(jié)果中可見，3D-CNN模式的診斷靈敏度(79.52%)、特異度(89.24%)、準確度(85.14%)均最高。見表2。

表2 三種預測模型對預測集的診斷結(jié)果

3 討論

3D-CNN模型在醫(yī)學領域的運用仍以科學研究為主，尤以結(jié)腸癌領域最為多見。Hildebrand等[2]開發(fā)了一種基于無癥狀的癌癥篩查方法：通過血液學檢查、年齡和性別等特征，基于GBDT和隨機森林算法來鑒定受試者是否具有結(jié)腸直腸癌的風險，其模型檢測結(jié)腸直腸癌的AUC達到0.82。Zhou等[3]使用多層3D-CNN用于肺結(jié)節(jié)檢測可使診斷模型假陽性減少，所提出的算法在LUNA比賽中獲獎[4-5]。本次研究采用肺癌組及良性組訓練集，訓練基于靶掃描的3D-CNN網(wǎng)絡模型后，其分類準確率較前提高、誤分率減少。但經(jīng)卡方檢驗，訓練集及預測集準確率差異無統(tǒng)計學意義，可能與本研究訓練集及預測集樣本量過少有關，該模型預測集僅為單中心60人次，還需要多中心大樣本的研究加強對模型的訓練。

另一方面，國外有學者在3 000例受試者的痰液中發(fā)現(xiàn)其中6個基因(p16、MGMT、DAPK、 RASSFIA、 PAX513及GATA5)與早期肺癌的風險增高有關[6]。本次研究發(fā)現(xiàn)肺癌組和良性組外周血pl6、 RASSFIA基因啟動子甲基化水平有顯著性差異，證實了上述觀點。

然而，由于早期肺癌的發(fā)生發(fā)展極其復雜，近年來發(fā)展起來的多腫瘤標志聯(lián)合檢測也存在相互作用等難以解決的統(tǒng)計學問題[7]。結(jié)直腸癌領域的拓荒者和實踐者鄭樹教授[8]將神經(jīng)網(wǎng)絡聯(lián)合多種腫瘤標志物用于鑒別消化道惡性腫瘤，建立的人工智能消化道腫瘤模型能較好地鑒別肝癌、腸癌和胃癌等消化道腫瘤。本文在我院小樣本研究中利用p16和RASSFIA兩種基因組合及受試者影像學特征建立了基于Fisher判別及決策樹及3D-CNN等三種模型的早期肺結(jié)節(jié)智能診斷模型，其中3D-CNN模型對早期肺癌及肺良性疾病的判別敏感性及特異性較高(分別為79.52%和89.24%)。

綜上所述，本研究從肺癌遺傳易感標志和早期效應標志2個方面為切入點，篩選了p16和RASSFIA基因甲基化水平以及應用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)中的3D人工神經(jīng)網(wǎng)絡檢測初步構(gòu)建了肺癌-肺良性疾病輔助診斷模型，為高危人群的篩查和臨床肺癌的早期診斷提供有價值的參考資料，對于提高肺惡性腫瘤患者總體的生存率有積極的意義。但該模型預測集僅為單中心60人次，還需要多中心大樣本的研究，且未進行全基因組測序明確甲基化結(jié)果，有待進一步研究加以證實。