姜巖，李玉欣，陳立功，李文杰

(1.重慶工商大學 廢油資源化技術與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067；2.哈爾濱工業(yè)大學(威海) 海洋科學與技術學院，山東 威海 264209)

生物柴油是一種重要的可再生能源，可以無限的生產(chǎn)，并具有許多環(huán)境友好的特性，如含硫量低、更易被降解，并且不包含對環(huán)境造成污染的芳香族化合物。由于用植物油為原料生產(chǎn)成本高且產(chǎn)量有限，而以餐飲廢棄油為原料，也存在原料難以收集等問題，利用微生物油脂發(fā)酵成了一個重要的研發(fā)方向[1-2]。

單細胞油脂的組成和一般植物油相近，以C16和 C18脂肪酸，如油酸、棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸等為主，但不飽和度更高[3]，因而生產(chǎn)的生物柴油的品質好[4]。利用微生物油脂制備生物柴油具有很多優(yōu)勢，如：微生物生長迅速、生長周期短、生長原料廣泛且價格便宜；可以人工調控且需要勞動力少；受季節(jié)、場地、環(huán)境制約?。荒苓B續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)成本較低[5]。因而通過微生物法制備生物柴油對柴油產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本文對產(chǎn)油微生物的種類、篩選和微生物柴油的制備流程進行了綜述，并對未來的研究方向進行了展望。

1 產(chǎn)油微生物的研究現(xiàn)狀

部分微生物在適宜條件下生產(chǎn)并儲存的油脂含量占其生物總量的20%以上，具有這種特性的菌株一般被稱為產(chǎn)油微生物[6]。目前，已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)油微生物包括酵母菌、霉菌、藻類和細菌等。其中，酵母菌作為單細胞真核微生物，常見的產(chǎn)油菌有產(chǎn)油油脂酵母(Lipomyceslipofer)、彎隱球酵母(Cryptococcusalbidum)、淺白色隱球酵母(Cryptococcusalbidus)、彎假絲酵母(Candidacurvata)、斯達氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、膠粘紅酵母 (Rhodotorulaglutinis)、圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、茁芽絲孢酵母(Trichospironpullulans)、雙倒卵形紅冬孢酵母(Rhodosporidiumdiobovatum)等[7-8]，這類菌株細胞內油脂含量較高，可達菌體干重的30%～70%。霉菌是形成分支菌絲的真菌統(tǒng)稱。目前發(fā)現(xiàn)的常見產(chǎn)油霉菌有深黃被孢霉(Mortierellaisabellina)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、葡酒色被孢霉(Mortu-erellavinacea)、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、紫癜麥角菌(Clavicepspurpurea)、高梁褶孢黑粉菌(Tolyposporiumehrenbergii)等[9-10]。霉菌油脂含量約為菌體干重的20%～70%。此外，海洋中許多藻類都能產(chǎn)生油脂，其中微藻以其獨特的優(yōu)點在產(chǎn)油藻類中凸顯出來，近年來成為了研究的熱點。微藻個體小，平均大約只有5 mm，生長繁殖快，對外界環(huán)境適應力強，在陸地、海洋分布廣泛，幾乎在有光和潮濕的任何地方，微藻都能生存，并且產(chǎn)油培養(yǎng)過程容易，對光的利用效率高。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾百種富油微藻，直接提取得到的油脂組分與植物油類似，可以作為植物油的替代品，更是優(yōu)良的生物柴油生產(chǎn)原料?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含油量較高的微藻有硅藻(Diatom)、綠藻(Chlorophyta)、葡萄藻(Botryococcusbraunii)、杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)、小球藻(Chlorellavulgaris)等[11]。藻類油脂含量約為菌體干重的25%～65%。相比之下，產(chǎn)油細菌油脂含量較低，為20%～40%，常見的有：分枝桿菌(Mycobacterium)和棒狀桿菌(Corynebacterium)等。細菌在高葡萄糖時產(chǎn)生不飽和甘油三酸酯，但大多數(shù)產(chǎn)油細菌不產(chǎn)甘油三酯，而是積累復雜類脂，如磷脂與糖脂。由于細菌油脂主要分布于細胞外膜上，所以提取較為困難，故很難應用于工業(yè)生產(chǎn)。

2 產(chǎn)油微生物的篩選與培養(yǎng)

野生型產(chǎn)油菌株往往效率很低，因而高效誘變株成為發(fā)展方向。

傳統(tǒng)誘變方法。即利用物理誘變劑(如α射線、γ射線、紫外輻射等)和化學誘變劑(如烷化劑、核酸堿基類似物等)等誘使微生物發(fā)生突變，進而篩選出高產(chǎn)油菌株的誘變方法。Yamada等[12]通過紫外線得到了誘變酵母突變株，產(chǎn)脂率是野生型的5倍。

針對微生物油脂代謝網(wǎng)絡，進行調整和結構優(yōu)化，來提高細胞的油脂含量[8]。主要有以下幾種思路：①增加油脂合成相關酶的表達量。Zhang 等[13]使圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)的乙酰CoA羧化酶和二?；视王；D移酶基因過量表達，促使菌體油脂含量增加了2倍；②抑制脂肪酸β氧化途徑。Courchesne等[14]通過部分抑制β-氧化可增加細胞油脂含量；③抑制中間代謝產(chǎn)物流向其他分支途徑。Athanasios等[15]將編碼3-磷酸甘油脫氫酶的GUT2基因敲除，使Δgut2突變株的油脂含量增加了 3 倍。

用轉座子隨機插入基因組，從而找出油脂合成相關基因。Kamisaka等[16]則通過轉座子突變在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中發(fā)現(xiàn)5個能促進菌體油脂含量積累的基因。這條研究路線得到了較好的處理效果。

3 生物柴油的制備

生物柴油制備的主要過程為：發(fā)酵→菌體的收集與預處理→油脂提取→生物柴油制備。

3.1 發(fā)酵

發(fā)酵過程作適當優(yōu)化調整可以提高油脂含量。除了通過控制通氣量、溫度、pH、光照，還可以控制營養(yǎng)元素的比例或添加一些小分子物質來提高油脂含量。①調整C/N比例。李永紅等[17]發(fā)現(xiàn)C/N 比在一定范圍內增加時，圓紅冬孢酵母菌(Rhodosporidiumtoruloides)油脂含量也隨之增加，達到420 時，油脂含量達到最高值76%。②調整C/P比。李永紅等[17]還發(fā)現(xiàn)C/P比適度增加，也會提高菌體油脂含量。③調整C/S比。Wu等[18]在研究Rhodosporidumtoruloides時發(fā)現(xiàn)，S同樣起著很重要的作用，硫限制時，細胞油脂含量不再隨C/N而變化。④添加其他一些小分子物質。Papanikolaou等[19]發(fā)現(xiàn)加少量甜橙精油到Yarrowialipolytica的培養(yǎng)基質中，便能使產(chǎn)物中飽和脂肪酸含量大幅增加。

另外還可以應用不同發(fā)酵模式調控油脂發(fā)酵。通常利用微生物生產(chǎn)胞內產(chǎn)物，可以采用的培養(yǎng)方式有3種：批式培養(yǎng)、補料-批式培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。其中補料-批式培養(yǎng)模式可方便控制限制因子濃度，獲得了廣泛應用。Liang等[20]利用粗甘油為碳源培養(yǎng)Cryptococcuscurvatus，發(fā)現(xiàn)補料-批式培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)結束時，菌體量和油脂含量均比批式培養(yǎng)高。

3.2 菌體預處理

油脂多包含在菌體細胞內，為了提高油脂的萃取率，有必要在提取油脂之前對菌體細胞進行預處理，使得內部油脂更容易釋放出來。菌體常見的預處理方法有：①基于機械剪切力的研磨、高壓、激光、超聲波、電場等；②反復凍融法，即利用低溫冰凍后生成的冰晶達到破壁目的；③與稀鹽酸共煮法，即是用一定濃度的稀鹽酸對菌體細胞進行處理，破壞其細胞壁結構，再加熱煮沸進一步使得細胞裂解；④菌體自溶法，如將酵母在50 ℃下保溫 2～3 d，自行消化后回收油脂；⑤酶處理法，即用細胞壁降解酶，如木聚糖酶、纖維素酶等處理菌體；⑥有機溶劑處理，如利用乙醇或丙酮破壞細胞膜，使結合蛋白變性[21-23]。

預處理方法選擇上還要根據(jù)原料材質決定[24]，研發(fā)高效低成本的預處理技術對后續(xù)油脂提取很重要。

3.3 油脂提取

油脂提取也是制備生物柴油的關鍵環(huán)節(jié)，常用的方法包括有機溶劑法、索氏提取法、超臨界CO2萃取法(SFE)等。這些方法在諸多工業(yè)領域中應用，屬于通用技術。

3.4 化學法制備生物柴油

目前，生物柴油的制備方法主要有化學法、物理法、生物酶法三類，以化學酯交換法研究最為廣泛。該法是采用脂肪酸甘油酯和甲醇在催化劑的催化下進行酯交換反應，產(chǎn)生脂肪酸甲酯和甘油。

3.4.1 均相催化酯交換 通過加入鹽酸、硫酸、磷酸，或NaOH、KOH等均相酸或堿催化劑，使催化反應高效進行。與均相酸催化法相比，堿催化更快，約為酸催化劑4 000倍，但堿會與游離的脂肪酸發(fā)生皂化反應，發(fā)生乳化，使得催化劑不易去除，水又會促進甲酯的水解。均相酸催化法雖受游離脂肪酸影響小，但耗時較長，對設備有一定腐蝕，且耗用甲醇量較多，當體系中水和游離脂肪酸含量較高時，可考慮選擇酸催化劑催化[25]。

3.4.2 多相催化酯交換 多相催化法最大的優(yōu)點在于大大方便了催化劑的分離，有利于去除游離脂肪酸雜質[26]。采用的催化劑常有硫酸化金屬氧化物、磺酸離子交換樹脂、磺酸改性介孔二氧化硅、磺化碳基催化劑等[27]，并且具有對設備腐蝕性小、環(huán)境污染小的優(yōu)點。但反應速率較慢，主要是因為醇和油兩相不互溶，阻礙了反應的進行。夏禹杰等[28]使用雙醚類物質作為共溶劑，使甘油三酸酯和低級醇形成均相反應體系，從而增大了反應界面，加快了反應速度。

3.4.3 亞臨界酯交換法 在溫度接近甲醇超臨界溫度下，催化酯交換反應，在一定程度上彌補了均相、多相催化酯交換和超臨界酯交換的缺陷。該方法使用固體催化劑，使后續(xù)的催化劑分離更加容易；在亞臨界狀態(tài)下甲醇和油脂的互溶度增加，提高了反應速度；對原料的含水量、酸值要求不高，降低了預處理等成本；解決了高溫高壓問題，對設備的要求降低[29]。

3.4.4 超臨界酯交換法 甲醇在超臨界狀態(tài)下與油脂的互溶度極大增加，甲醇既是反應物又是催化劑，使分離更加簡單；反應對油脂要求低，使預處理簡單。此外，甲基酯的轉化率高，并且對環(huán)境污染小。主要的缺點為反應是在高溫高壓下進行，對設備條件要求高，使大規(guī)模應用受阻。Kusdiana等[30]提出超臨界流體二步法，即水解、酯化二步法合成生物柴油的工藝。首先將油脂在亞臨界狀態(tài)下水中水解成脂肪酸，脂肪酸在超臨界甲醇條件下發(fā)生甲酯化反應生成脂肪酸甲酯。此法的脂肪酸與甲醇發(fā)生酯化的溫度壓力條件更溫和，但工藝流程變得相對復雜，目前研究還不夠深入，在未來此種改進方法可能會有很好的應用[31]。

4 結束語

開發(fā)綠色替代能源已經(jīng)成為發(fā)展趨勢。微生物油脂以其獨特的優(yōu)點很可能成為生物柴油的重要原料來源，然而以微生物油脂為原料的第三代生物柴油技術還未成熟，原因在于生產(chǎn)成本較高、不能高效規(guī)模化生產(chǎn)采集油脂。未來可從以下幾方面進行研究：

(1)尋求更加廉價而高效的原料用于產(chǎn)油微生物發(fā)酵。

(2)繼續(xù)深入研究產(chǎn)油微生物的篩選、改良和培育，最好能結合處理有機廢棄資源，創(chuàng)造更加經(jīng)濟環(huán)保的生產(chǎn)方式。

(3)對微生物油脂合成代謝網(wǎng)絡繼續(xù)深入分析，找到關鍵因素，在提高油脂產(chǎn)量上，找到新突破口。

(4)優(yōu)化工藝，探求可廉價高效提取微生物油脂的新方法。