熊娟 龐月珊 吳憂 任海波

(南充市中心醫(yī)院 1.特需醫(yī)療科；2.老年科；3.神經(jīng)外科，四川 南充 637000)

急性腦梗死在全世界都具有較高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率。急性腦缺血發(fā)生后，腦中血管神經(jīng)單元受到損傷，及時恢復(fù)腦血流是目前主要治療措施之一，但可能誘發(fā)缺血/再灌注損傷。缺血再灌注損傷后小膠質(zhì)細胞迅速活化，可釋放炎性介質(zhì)及細胞因子再次損傷腦組織[1]?；罨男∧z質(zhì)細胞同樣在血管生成中起著重要的作用[2]，但研究小膠質(zhì)細胞對腦血管的影響較少。Tβ4是由43個氨基酸構(gòu)成的多肽具有廣泛的生物活性，包括神經(jīng)保護[3]，誘導(dǎo)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的血管生成[4]。研究顯示外源性Tβ4可通過PI3K/AKT/eNOS信號通路刺激內(nèi)皮祖細胞定向遷移[5]，在急性和慢性缺血模型中對內(nèi)皮祖細胞都起到保護作用[6]。PI3K/AKT信號通路是血管新生重要的信號通路，其激活后可以上調(diào)下游的mTOR、eNOS、HIF1α和VEGF等表達促進血管新生[7-10]。PI3K/AKT通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和修復(fù)中起到核心作用。全腦缺血后小膠質(zhì)細胞高表達Tβ4[11]，且Tβ4與PI3K/AKT通路相關(guān)[5, 12-13]，膠質(zhì)源性的Tβ4是否通過PI3K/AKT通路參與局灶腦缺血/再灌注損傷后的修復(fù)尚不清楚。本研究旨在探討缺血再灌注/損傷后小膠質(zhì)細胞中Tβ4的表達變化及其對PI3K/AKT通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 21只成年雄性SPF級SD大鼠，體重(200±20) g (上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)20130016)。大鼠被飼養(yǎng)在特定的無病原體的條件下，自由獲得食物和水。動物實驗獲得四川省實驗動物學(xué)會倫理委員會批準(2021-05)，并按照動物實驗機構(gòu)指導(dǎo)原則進行。

1.2 局灶腦缺血/再灌注損傷模型、細胞氧糖剝脫/再灌注損傷模型 參考文獻制作局灶腦I/R模型[14]，動物隨機分為假手術(shù)組(Sham組)(n=6)、模型組(I/R組)(n=15)。先用3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。取仰臥位，備皮消毒后沿頸正中線切開皮膚2～3 cm，鈍性分離皮下組織及右側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈。用絲線暫結(jié)扎頸外動脈，經(jīng)總動脈，并在頸總動脈遠端置線并打結(jié)，便于固定栓線。夾閉頸內(nèi)動脈，用眼科剪在頸總動脈兩個綁線間剪個小口，插入栓線，打開夾閉頸內(nèi)動脈的動脈夾，栓線插入到距離頸內(nèi)、頸外分叉口18～20 mm處，直到出現(xiàn)輕微阻力，表明大腦前動脈和大腦中動脈起源處被阻斷，消毒縫合切口并置于37℃恒溫實驗臺上，直至蘇醒。缺血2 h后，輕輕向外提拉線栓10 mm，實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組織切開鈍性分離，不結(jié)扎血管和植入線栓。行為測試參照Zea-longa評分法[14]評價模型是否成功，9只成模大鼠再灌注后分別于24(I 2 h/R 24 h)、48(I 2 h/R 48 h)、72 h(I 2 h/R 72 h)麻醉處死大鼠取腦進行后續(xù)實驗(n=3)。OGD/R模型是根據(jù)文獻[15]制作，將制備好的BV2細胞(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞共享平臺)6×105/mL接種于無血清無糖DMEM培養(yǎng)基中并置于 1% O2、5% CO2、94% N2的三氣培養(yǎng)箱中分別孵育2、4、6 h；再灌注時，首先去掉無血清無糖的 DMEM 培養(yǎng)基，再加入含10%血清的DMEM F12膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基中，分別在24、48、72 h進行檢測。

1.3 Tβ4 shRNA轉(zhuǎn)染 使用轉(zhuǎn)染效率較高的Tβ4 shRNA序列：正義鏈5′-GGTTGGATCAAGTTTAA AT-3，反義鏈 5′-ATTTAAACTTGATCCAACC-3′。對照shRNA由一個混亂的序列組成，不能針對任何已知的細胞mRNA。免疫熒光分析評價檢測基因干擾后Tβ4表達，然后將細胞用于OGD/R造模。分為對照組、OGD/R組、shRNA Tβ4+Control組、shRNA Tβ4+OGD/R組、Control shRNA+Control組、Control shRNA+OGD/R組。對照組細胞置于含10%血清的DMEM F12膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基中37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 蛋白免疫印跡實驗 使用添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑RIPA裂液提取細胞蛋白。采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，蛋白變性，并按50 ug/孔標準向12%的SDS-PAGE分離膠加入樣本并進行電泳1 h，轉(zhuǎn)膜45 min。脫脂奶粉封閉 2 h，洗膜后與稀釋的兔抗AKT、兔抗磷酸化AKT (Ser473)、兔抗PI3K、兔抗磷酸化PI3K (1∶800，CST)和小鼠抗β-actin(1∶1000，碧云天生物技術(shù)公司)一抗共孵育4℃過夜；復(fù)溫1 h，洗膜后與辣根-過氧化物酶標記二抗(碧云天生物技術(shù)公司)室溫孵育 1 h。膜上滴加ECL曝光液，在Bio-Rad儀對條帶進行掃描并使用“Quantity one”軟件分析。

1.5 細胞免疫熒光、免疫組化實驗 細胞免疫熒光：去掉培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定10～15 min，使用PBS反復(fù)清洗3次清洗后加入Tβ4一抗4℃孵育過夜(1∶400, SANTA CRUZ), 復(fù)溫1 h，洗滌后使用山羊抗小鼠FITC抗體(1∶1000，碧云天生物技術(shù)公司)避光室溫孵育2 h, DAPI染核色(100 ng/mL) 10 min，最后顯微鏡熒光顯微鏡成像。免疫組織化學(xué)：將大鼠麻醉后經(jīng)心臟灌注生理鹽，再灌注4%多聚甲醛，取大腦經(jīng)過固定、脫水后石蠟包埋。將病變部位大腦切成6 μm厚的切片。經(jīng)常規(guī)脫蠟水化，室溫用3%雙氧水作用10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。將Tβ4抗體按1∶200稀釋，4℃孵育過夜，洗滌后脫脂奶粉封閉2 h，再次洗滌后加入HRP標記的二抗，室溫靜置30 min，加DAB顯色液，顯色5～10 min，用蘇木精復(fù)染2 min，乙醇分化、脫水、透明，樹脂膠封片。OLYMPUS PM20顯微鏡和TCFY-2050病理系統(tǒng)下觀察和成像。使用ImageJ對免疫組化圖片和免疫熒光圖片進行量化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism 9.1軟件進行數(shù)據(jù)分析并做統(tǒng)計圖，兩兩比較采用Unpairedttest檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 I/R損傷后大腦皮質(zhì)Tβ4表達水平升高 免疫組化檢測腦組織中Tβ4的表達結(jié)果顯示，與假手術(shù)相比，大鼠局灶性腦缺血/再灌注的24、48、72 h大腦皮層均有Tβ4表達增多，根據(jù)細胞形態(tài)可初步推斷Tβ4在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞高表達，梗塞部位以及梗塞周圍Tβ4的表達以膠質(zhì)細胞為主(圖1A)。對免疫組化進行平均光密度值統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，I 2 h/R 48 h Tβ4表達水平顯著升高 (P< 0.0001)，見圖1B。

圖1 局灶腦缺血2 h/再灌注24、48、72 hTβ4表達情況 Figure 1 The expression of Tβ4 at focal cerebral ischemia 2h/reperfusion 24, 48, 72 h注：A.各組大鼠腦皮質(zhì)Tβ4表達情況(標尺=50 μm)；B.各組平均光密度值。與Sham組比較，①P<0.05

2.2 BV2細胞在氧糖剝奪/再灌注損傷后高表達Tβ4 免疫熒光法檢測BV2細胞OGD/R損傷后Tβ4蛋白的表達結(jié)果顯示，與對照組相比，氧糖剝奪2、4、6 h復(fù)氧48 h組Tβ4表達較多， 其中OGD 6 h/ R 48 h組表達最多(P<0.0001)。OGD 2 h/R 72 h和OGD 4 h/ 24 h組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。OGD 2 h、OGD 4 h和OGD 6 h組Tβ4都是再灌注后48 h達到峰值，表明Tβ4蛋白表達與氧糖剝奪/再灌注的時間有一定的相關(guān)性。見圖2。故我們選擇在該實驗中Tβ4表達相對較多的OGD 6 h/R 48 h組進行后續(xù)干預(yù)實驗。

圖2 Tβ4在不同組的BV2細胞中表達Figure 2 The expression of Tβ4 in BV2 cells in different groups 注：A、B為Tβ4免疫熒光染色(標尺=50 μm)；C.平均光密度。與對照組比較，①P < 0.05

2.3 BV2細胞表達的Tβ4調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路表達 為了驗證BV2表達的Tβ4對PI3K/AKT通路的影響，我們選擇在該研究中Tβ4表達相對較多的OGD 6 h/R 48 h組進行干擾。結(jié)果顯示，使用shRNA Tβ4干擾BV2 細胞在進行氧糖剝奪/再灌注實驗，其中Tβ4蛋白表達明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3A、B。使用對照序列轉(zhuǎn)染組與OGD 6 h/R 48 h組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同時使用WB方法檢測PI3K/AKT通路蛋白表達發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，OGD 6 h/R 48 h組p-PI3K/PI3K比值顯著升高(P<0.05)，而Tβ4 shRNA OGD 6 h/R 48 h組的p-PI3K/PI3K比值較OGD 6 h/R 48 h組明顯降低(P<0.05)，見圖3C、D。與對照組相比較，OGD 6 h/R 48 h組p-AKT/AKT比值較高(P<0.05)，但Tβ4 shRNA干預(yù)后，降低了p-AKT/AKT比值(P<0.05)，見圖3E。結(jié)果表明，BV2細胞在OGD/R損傷后高表達的Tβ4可能調(diào)控PI3K/AKT信號通路。

圖3 BV2細胞表達的Tβ4 對PI3K/AKT 通路影響Figure 3 The effect of Tβ4 expressed in BV2 on PI3K/AKT pathway注：A、B為Tβ4基因干擾后Tβ4蛋白表達情況及平均光密度值(標尺=50 μm)；C.WB檢測p-AKT、 AKT、p-PI3K、PI3K、β-actin表達；D、E分別為p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K統(tǒng)計分析。與對照組比較，①P<0.05

3 討論

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細胞，可參與免疫調(diào)節(jié)[16]和腦組織發(fā)育[17]。傳統(tǒng)上認為小膠質(zhì)細胞的活化在缺血性腦卒中是有害的，抑制小膠質(zhì)細胞活化治療腦卒中的方法得到廣泛研究。然而，越來越多的證據(jù)表明，小膠質(zhì)細胞的激活對神經(jīng)發(fā)生、血管生成和突觸重塑也至關(guān)重要，促進腦缺血后的功能恢復(fù)[18]。目前小膠質(zhì)細胞對卒中后血管生成的影響已經(jīng)成為研究熱點[18-20]。Kubota等[21]研究顯示在缺失小膠質(zhì)細胞的小鼠視網(wǎng)膜中，血管的分支明顯減少。Ding等[2]認為活化的小膠質(zhì)細胞可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞緊密連接破壞，同時促進內(nèi)皮生長因子分泌促進新生血管的形成。Zhu等[19]研究也發(fā)現(xiàn)小檗堿通過AMPK信號通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞極化促短暫性大腦中動脈閉塞模型血管生成。

局灶腦缺血/再灌注損傷后，在腦缺血區(qū)域周圍有小膠質(zhì)細胞增多[22]，但該區(qū)域小膠質(zhì)細胞與血管生成的關(guān)系尚不清楚。Tian等[23]觀察到BV2小膠質(zhì)細胞顯著促進毛細血管樣管形成和腦微血管內(nèi)皮細胞遷移，并且這種作用與酪氨酸蛋白激酶A相關(guān)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)局灶腦缺血/再灌注損傷后位于大腦皮質(zhì)區(qū)周圍區(qū)域的小膠質(zhì)細胞Tβ4水平較高，尤其是在I 2 h/R 48 h組，同時我們體外實驗證實BV2細胞在OGT/R造模后同樣有Tβ4高表達。使用shRNA 干擾Tβ4表達后，p-PI3K、p-Akt表達也相應(yīng)減少，但PI3K/AKT通路的表達并未完全受到抑制，說明Tβ4不是缺血/再灌注損傷后影響PI3K/AKT通路的唯一因子。Kim等[24]也觀察到全腦缺血后可誘導(dǎo)海馬齒狀回小膠質(zhì)細胞Tβ4高表達，與本研究結(jié)果相似。綜上可知，腦缺血再灌注損傷后小膠質(zhì)細胞有Tβ4表達，并且可能參與PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)。

PI3K/AKT信號通路是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞生存能力及血管再生的關(guān)鍵通路[25-26]，也是參與局灶腦缺血/再灌注損傷修復(fù)的關(guān)鍵通路。Trenkwalder等[13]研究發(fā)現(xiàn)，肌肉注射Tβ4治療14 d，血管生成增加，且與PI3K/AKT通路相關(guān)。此外，另一項研究也表明Tβ4可以通過激活A(yù)KT/eNOS促進血管生成[27]。Tβ4激活PI3K/AKT通路后，可調(diào)控eNOS表達，進而刺激內(nèi)皮祖細胞的定向遷移和分化[5,12,27]。研究顯示Tβ4不僅能增強內(nèi)皮祖細胞的活力、血管生成能力和遷移能力，還能使內(nèi)皮祖細胞高表達血管內(nèi)皮生長因子A、血管緊張素及血管生成素受體促進血管生成[28]。Tβ4也能通過激活內(nèi)皮蛋白水解系統(tǒng)，抑制內(nèi)皮細胞粘附，促進內(nèi)皮細胞的遷移和毛細血管形成[29]。綜上，我們推測局灶腦缺血/再灌注損傷后小膠質(zhì)細胞高表達Tβ4也可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路影響血管生成，促進局灶腦缺血/再灌注損傷的修復(fù)。接下來我們將進一步研究Tβ4對PI3K/AKT通路下游信號因子及血管生成的影響，進一步揭示小膠質(zhì)細胞對局灶腦缺血/再灌注損傷后血管生成的影響機制。

4 結(jié)論

局灶腦缺血/再灌注損傷后，大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞高表達Tβ4，并且小膠質(zhì)細胞高表達的Tβ4可能通過PI3K/AKT影響腦缺血/再灌注損傷的修復(fù)。