何玉華 瞿波 陳文 何金室 朱家恒 李明權(quán)

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease，CKD)是一種并發(fā)癥多，破壞性強(qiáng)，不可逆轉(zhuǎn)的疾病。近年來，諸多證據(jù)表明CKD患者的腸道微生物組與宿主的病理生理狀態(tài)相關(guān)[1-2]，有學(xué)者據(jù)此提出了“腸-腎軸(Gut-Kidney Axis)”理論[3]。該理論的核心觀點認(rèn)為腸道與CKD之間存在雙向作用，一方面腎臟功能受損導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)、腸道屏障功能破壞；另一方面腸道菌群及其代謝毒素通過受損的腸黏膜屏障入血，激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，釋放大量細(xì)胞因子、炎癥因子、氧自由基等細(xì)胞毒性物質(zhì)，誘發(fā)慢性炎癥，從而加速腎臟損傷。由此可知，腸道屏障功能受損是“腸-腎軸”致病過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我國自20世紀(jì)60年代開始就把結(jié)腸作為中藥治療CKD的靶點，利用大腸傳導(dǎo)糟粕以降濁的功能特點，祛邪外達(dá)，調(diào)整陰陽，延緩疾病進(jìn)展。本研究旨在通過觀察大鼠灌腸含藥血清對脂多糖誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥模型的干預(yù)效果，探討中藥灌腸對腸道機(jī)械屏障的影響，為中藥灌腸治療CKD提供更多理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(NCM460，CL0172，豐暉生物)，SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(200±26)g。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(07-6096，山東Biologix)，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(07-6006，山東Biologix)，離心管(LPLXG，15 mL，杭州LABSELECT)，高糖培養(yǎng)基(DMEM，PM150210，武漢普諾賽)，胎牛血清(FBS，10100，500 mL，北京Gibco)，雙抗(SV30010，100 mL，美國HyClone)，胰酶(+EDTA，S310JV，100 mL，上海源培生物)，CCK-8(BS350B，5*100T，安徽Biosharp)，二甲基亞砜(DMSO，D5879，100 mL，美國Sigma-Aldrich)，PBS緩沖液干粉(201201A17，1L，上海遠(yuǎn)慕生物)，Rat IL-6 ELISA KIT(ZC-36404，48Test，上海茁彩生物)，Rat TNF-α ELISA KIT(ZC-37624，48 Test，上海茁彩生物)，Western、IP細(xì)胞裂解液(P0013，上海Beyotime)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009，上海Beyotime)，PAGE凝膠快速制備試劑盒(PG112，上海雅酶生物)，預(yù)染蛋白Marker(180kDa，RM19001，武漢ABClonal)，預(yù)染蛋白Marker(250kDa，26619，美國Thermo Fisher Scientific)，ECL發(fā)光試劑盒(KF001，江蘇Affinity Biosciences)，Immobilon-PSQ PVDF膜(ISEQ00010，美國Sigma-Aldrich)，Glycine (1275GR500，廣州Biofroxx)，Tris for molecular biology (1115GR500，廣州Biofroxx)，十二烷基磺酸鈉(SDS，1177GR500，廣州Biofroxx)，過硫酸銨溶液(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸異丙醇溶液(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，ZO-1抗體(兔克隆抗體，AF5145，江蘇Affinity Biosciences)，Claudin1抗體(兔克隆抗體，AF0127，江蘇Affinity Biosciences)，Occludin抗體(兔克隆抗體，91131，美國Cell Signaling Technology)，β-actin抗體(兔克隆抗體，AC026，武漢ABClonal)，生物素化山羊抗兔IgG(H+L，ab6721，英國Abcam)。

1.2 實驗設(shè)備 倒置生物顯微鏡(DMI1，德國LEICA)，臺式低速離心機(jī)(TDZ4-WS，長沙湘儀集團(tuán))，高速低溫離心機(jī)(H2050R，長沙湘儀集團(tuán))，二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-15AC，日本SANYO)，壓力蒸汽滅菌器(SYQ-DSX-280B，上海宜川儀表廠)，水浴鍋(HH-1，金壇市榮華儀器制造有限公司)，優(yōu)譜超純水制造系統(tǒng)(UPH-II-10T，成都超純科技有限公司)，酶標(biāo)儀(SpectraMAX Plus 384，美國Molecular Devices)，移液槍(2、10、20、200、1000 μL，北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)，槍頭(20、200、1000 μL，美國Axygen)，EP管(1.5 mL、0.2 mL、100 μL，美國Axygen)，垂直電泳槽(JY-SCZ4+，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，電泳儀(JY200C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，水平脫色搖床(TY-80A，江蘇科析儀器有限公司)，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(5200，上海天能科技有限公司)，全功能酶標(biāo)儀(MK3，美國Thermo Fisher Scientific)，超低溫冰箱(DW-86L386，海爾集團(tuán))。

1.3 方法

1.3.1 中藥灌腸液制備 課題組前期通過數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果創(chuàng)立健脾益腎泄?jié)釡?，含黃芪、大黃、煅牡蠣、蒲公英、丹參、附子。上述藥物均采購于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，中藥灌腸液由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部自動煎藥機(jī)煎煮。

1.3.2 含藥血清提取 40只SPF級SD大鼠，隨機(jī)分為空白組、低劑量中藥灌腸組、中劑量中藥灌腸組、高劑量中藥灌腸組，每組10只。根據(jù)公式測算[4]并結(jié)合前期預(yù)實驗結(jié)果，空白組不予灌腸，低、中、高劑量組按1∶2∶4分別予0.4、0.8、1.6 mL中藥灌腸。大鼠固定于鼠板，頭朝斜下，尾朝斜上，露出肛門。藥液與大鼠肛門溫度相近(37.5～39℃)。將直頭灌腸軟管緩慢輕柔插入大鼠肛門，固定軟管，緩慢注射藥物，灌腸后予固定體位30 min。大鼠每天灌腸2次，連續(xù)灌腸5 d。于末次灌腸1 h后腹主動脈取血，3000 r/min離心15 min，分離血清，收集上層血清，微孔濾膜過濾后置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇:將NCM460細(xì)胞凍存管放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動管身，待凍存液融化后轉(zhuǎn)入超凈臺，轉(zhuǎn)移入15 mL離心管，按凍存液3倍體積加入新鮮培養(yǎng)基，250 g離心5 min，吸棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基，放置孵箱培養(yǎng)。細(xì)胞傳代：吸棄舊培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，吸棄液體，加入孵溫的胰酶，輕晃培養(yǎng)瓶以使消化液完全浸潤細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，則加入胰酶體積3倍的新鮮培養(yǎng)基終止消化。將消化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移入15 mL離心管，250 g離心5 min，吸棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基，以1∶3傳代培養(yǎng)。

1.3.4 細(xì)胞模型建立及分組 細(xì)胞分為空白組(Blank Group，BG)、模型組(Model Group，MG)、低劑量中藥灌腸血清組(Low-dose Enema Group，LDEG)、中劑量中藥灌腸血清組(Medium-dose Enema Group，MDEG)、高劑量中藥灌腸血清組(High-dose Enema Group，HDEG)。除空白組外，其余各組均加入脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)100 μg/mL誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥損傷。中藥灌腸血清組于加入LPS前2 h，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為10%含藥血清，模型組加入空白組大鼠血清，各組均孵育24 h后檢測相應(yīng)指標(biāo)。

1.3.5 CCK-8檢測細(xì)胞活性、抑制率 取對數(shù)生長期的NCM460細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌，胰蛋白酶消化后收集，250 g離心5 min，吸棄上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細(xì)胞懸液。調(diào)節(jié)細(xì)胞密度5×104/mL，100μL/孔接種于96孔板中(邊緣孔用無菌PBS填充)，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置空白組(BG)、模型組(MG)、低劑量中藥灌腸血清組(LDEG)、中劑量中藥灌腸血清組(MDEG)、高劑量中藥灌腸血清組(HDEG)，每組重復(fù)4個樣本。待藥物作用24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑， 37℃、5% CO2恒溫繼續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度(OD值)。抑制率=(1-實驗組OD/空白組OD)×100%。

1.3.6 ELISA檢測細(xì)胞上清IL-6、TNF-α水平 將所有試劑平衡至室溫?？瞻讓φ湛撞患訕悠罚患语@色劑A、B和終止液；標(biāo)準(zhǔn)品孔，加入配好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，然后加入辣根過氧化物酶100 μL。待測樣品孔，加入樣本50 μL，然后辣根過氧化物酶100 μL，蓋上封板膜，37℃溫育60 min。每孔加滿洗滌液，靜置1 min后吸棄，如此重復(fù)5次，拍干。顯色：每孔先加入底物液A 50 μL，再加入底物液B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。在15 min內(nèi)，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

1.3.7 Western Blot檢測Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白水平 取NCM460細(xì)胞樣本，加入RIPA裂解液(細(xì)胞:裂解液=1:10)，裂解10min后收集裂解液，4℃、12000 rpm離心10 min。后取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。各實驗組取50 μL，按4∶1比例加入5×Loding buffer，混勻后熱循環(huán)儀95℃，15 min，-80℃保存。待積層膠凝固后拔出，置入電泳槽中電泳。將PVDF膜與分離膠同時放入轉(zhuǎn)膜液中平衡10 min。將凝膠面與負(fù)極相連，PVDF膜與正極相連，接通電源，200 mA轉(zhuǎn)膜1～2 h。將PVDF膜放入一抗(一抗?jié)舛?ZO-1 1∶1000；Cladudin-1 1∶1000；Occludin 1∶1000；β-actin 1∶100000)，4℃孵育過夜。用TBST沖洗3次，后將PVDF膜放入二抗(稀釋濃度：1∶5000)，室溫孵育2～3 h，再次用TBST沖洗洗3次。滴加ECL發(fā)光液顯色曝光，用天能GIS機(jī)箱控制軟件V2.0對條帶進(jìn)行曝光掃描，結(jié)果以目的蛋白相對表達(dá)量表示。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白積分光密度值(IOD)/內(nèi)參積分光密度值(IOD)。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活性、抑制率比較 經(jīng)LPS造模后，細(xì)胞活性降低；與空白血清干預(yù)相比，中藥灌腸的含藥血清可增強(qiáng)炎癥損傷細(xì)胞的活性，但不同劑量之間的作用效果未見差異；LPS造模后，細(xì)胞抑制率增加；與空白血清干預(yù)相比，高劑量中藥灌腸的含藥血清可降低炎癥損傷細(xì)胞的抑制率，低劑量與中劑量均未發(fā)現(xiàn)該效應(yīng)。見表1。

表1 不同分組細(xì)胞OD、抑制率Table 1 Determination of OD value of cells in different groups

2.2 各組細(xì)胞上清IL-6、TNF-α比較 經(jīng)LPS造模后，細(xì)胞上清IL-6水平升高；與空白血清干預(yù)相比，中藥灌腸的含藥血清可降低炎癥損傷細(xì)胞的上清IL-6水平，且高劑量的作用效果較低劑量與中劑量更為顯著。經(jīng)LPS造模后，細(xì)胞上清TNF-α水平升高；與空白血清干預(yù)相比，中藥灌腸的含藥血清可降低炎癥損傷細(xì)胞的上清TNF-α水平，且高劑量的作用效果較低劑量更為顯著。見表2。

表2 不同分組細(xì)胞IL-6、TNF-α比較Table 2 Determination of IL-6 in cells of different groups

2.3 各組細(xì)胞Claudin-1、Occludin、ZO-1相對表達(dá)量比較 經(jīng)LPS造模后，細(xì)胞Claudin-1相對表達(dá)量下降；與空白血清干預(yù)相比，中藥灌腸的含藥血清可增加炎癥損傷細(xì)胞的Claudin-1相對表達(dá)量，且作用強(qiáng)度與劑量成正比。與BG相比，MG的Occludin相對表達(dá)量降低；與MG相比，LDEG、MDEG、HDEG的Occludin相對表達(dá)量升遍；LDEG與HDEG間的Occludin相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計意義；LDEG與MDEG、MDEG 與HDEG之間的Occludin相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計意義。結(jié)果表明，經(jīng)LPS造模后，細(xì)胞Occludin相對表達(dá)量下降；與空白血清干預(yù)相比，中藥灌腸的含藥血清可增加炎癥損傷細(xì)胞的Occludin相對表達(dá)量，且高劑量的作用效果較低劑量更為顯著。經(jīng)LPS造模后，細(xì)胞ZO-1相對表達(dá)量下降；與空白血清干預(yù)相比，中藥灌腸的含藥血清可增加炎癥損傷細(xì)胞的ZO-1相對表達(dá)量，且高劑量的作用效果較低劑量更為顯著。見圖1～3，表3。

圖2 不同分組細(xì)胞Occludin表達(dá)電泳圖Figure 2 Electrophoresis of Occludin expression in different groups of cells

圖3 不同分組細(xì)胞ZO-1表達(dá)電泳圖Figure 3 Electrophoresis of ZO-1 expression in different groups of cells

表3 不同分組細(xì)胞Claudin-1、Occludin、ZO-1相對表達(dá)量比較Table 3 Relative expression of Claudin-1 in cells of different groups

3 討論

本實驗基于“腸-腎軸”理論，以健脾益腎泄?jié)釡笫蠊嗄c的含藥血清為干預(yù)手段，觀察人結(jié)腸上皮細(xì)胞腸道屏障相關(guān)蛋白及炎癥指標(biāo)的變化，探討該方灌腸對腸道機(jī)械屏障以及局部炎癥狀態(tài)的影響。研究結(jié)果顯示，健脾益腎泄?jié)釡焦嗄c含藥血清可增加炎癥損傷后NCM460細(xì)胞的OD值，增加Claudin-1、Occludin及ZO-1相對表達(dá)量，降低IL-6、TNF-α水平，且高劑量的效果更為顯著。

在腸道機(jī)械屏障功能正常的情況下，LPS無法進(jìn)入血液循環(huán)，而CKD患者腸道黏膜通透性增高，LPS可借此移位進(jìn)入血液循環(huán)，刺激炎癥細(xì)胞因子釋放，導(dǎo)致全身性炎癥狀態(tài)。多項研究證實了CKD患者/動物模型存在腸道機(jī)械屏障功能受損[5-7]。在體外試驗中，LPS/內(nèi)毒素亦可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷[8]。因此本實驗通過對NCM460細(xì)胞進(jìn)行LPS造模，模擬CKD患者腸上皮細(xì)胞炎癥狀態(tài)。結(jié)果顯示，經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞抑制率升高，細(xì)胞活性下降，提示細(xì)胞損傷。同時，LPS能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子，導(dǎo)致細(xì)胞上清IL-6、TNF-α水平均不同程度升高，與CKD患者的微炎癥狀態(tài)類似。

雖然中藥灌腸已廣泛應(yīng)用于CKD的治療當(dāng)中，但鮮有關(guān)于該法對腸道機(jī)械屏障功能影響的研究。腸道機(jī)械屏障，由腸上皮細(xì)胞和頂端連接復(fù)合體組成有濾過和屏蔽的雙向作用[9]。其中，緊密連接是頂端連接復(fù)合體最主要的連接方式[10]，主要由三個部分組成：粘附性跨膜蛋白，包括緊密連接蛋白(Claudin)和閉鎖蛋白(Occludin)家族；閉鎖小帶蛋白(Zonula Occluden，ZO)家族；肌動蛋白和肌球蛋白連接環(huán)。多項試驗表明，從緊密連接處去除Occludin，會降低緊密連接的穩(wěn)定性，導(dǎo)致屏障功能受損[11-12]。Claudin多種異構(gòu)體可以調(diào)節(jié)屏障功能[13]。本研究中，NCM460細(xì)胞經(jīng)過LPS處理后，其緊密連接相關(guān)結(jié)構(gòu)破壞，如Claudin-1、Occludin和ZO-1的表達(dá)量均下降，提示腸上皮細(xì)胞屏障功能受損。其他動物實驗也發(fā)現(xiàn)，CKD大鼠空腸和回腸上皮緊密連接的關(guān)鍵蛋白成分(Claudin-1、Occludin)顯著減少[14]。本實驗采用的健脾益腎泄?jié)釡珌碜杂谇捌跀?shù)據(jù)挖掘結(jié)果，含黃芪(30g)、大黃(30g)、煅牡蠣(30g)、蒲公英(20g)、丹參(20g)、附子(10g)。實驗結(jié)果顯示，該方灌腸含藥血清較空白血清能顯著提高腸上皮細(xì)胞活性，減少IL-6、TNF-α含量，增加Claudin-1、Occludin和ZO-1的表達(dá)。表明健脾益腎泄?jié)釡笫蠊嗄c的含藥血清可以增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞活性、增加腸上皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)，可能有助于保護(hù)腸道機(jī)械屏障功能，從而減輕局部炎癥狀態(tài)。有研究者利用單藥大黃灌腸，同樣發(fā)現(xiàn)中藥灌腸能改善大鼠腸道機(jī)械屏障功能，調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，抑制全身炎癥反應(yīng)，減輕腎纖維化[15]。鐘丹等[16]利用中藥復(fù)方(黃芪20 g、大黃30 g、牡蠣30 g、蒲公英30 g)對CKD大鼠模型灌腸，也發(fā)現(xiàn)通腑泄?jié)岱鼙Ｗo(hù)腸黏膜屏障功能?；謴?fù)腸道機(jī)械屏障功能可有效阻止腸腔內(nèi)的諸多有害物質(zhì)，如微生物、微生物代謝毒素、炎癥因子等進(jìn)入全身血液循環(huán)，理論上可減輕全身微炎癥狀態(tài)，減少腸源性毒素的蓄積，緩解尿毒癥毒素引起的臨床癥狀，延緩CKD持續(xù)進(jìn)展。一項針對IgA腎病的臨床研究表明，經(jīng)過4年的隨訪，腸道通透性增高患者的腎小球濾過率，其下降程度明顯大于腸道通透性正常的患者[17]。

當(dāng)中藥灌腸液進(jìn)入腸腔后，主要通過被動擴(kuò)散吸收入血，因此藥液吸收量與藥液的體積和濃度密切相關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，高劑量中藥灌腸組在多項指標(biāo)中均具有統(tǒng)計學(xué)差異，并且在IL-6、Claudin-1中顯示了藥液劑量-效應(yīng)關(guān)系。由此推導(dǎo)，在中藥灌腸的臨床應(yīng)用當(dāng)中，可提高藥液濃度，并在患者耐受程度內(nèi)增加藥液劑量，以求最大療效。本研究采用了中藥復(fù)發(fā)制劑，藥物成分復(fù)雜，現(xiàn)有條件難以確定目標(biāo)血藥濃度，因此無法進(jìn)行精確的血藥濃度測算，僅以劑量的倍數(shù)1∶2∶4確定低、中、高劑量分組，所以并未在全部實驗指標(biāo)中觀察到劑量-效應(yīng)關(guān)系。另外，中藥煎煮工藝的干擾因素多，不同批次藥液的濃度參差不齊，難以保證藥物等效性，也是造成這一實驗現(xiàn)象的可能原因。

受限于時間及經(jīng)費，本研究僅使用了Western blot檢測腸道緊密連接關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，未使用實時熒光定量PCR進(jìn)一步驗證。另外，本研究僅為細(xì)胞實驗，雖然結(jié)果表明中藥灌腸能夠一定程度的修復(fù)腸道機(jī)械屏障功能，但具體機(jī)制尚未可知。腸道通透性與腸道屏障功能相反，由于腸道黏膜必須同時促進(jìn)水分和營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，同時起到保護(hù)屏障的作用，因此需要更多的研究去揭示這兩種功能的轉(zhuǎn)換機(jī)制。

目前，針對腸道上皮屏障損傷的最佳療法是治療基礎(chǔ)疾病，而靶向修復(fù)上皮細(xì)胞具有治療前景，包括腸道干細(xì)胞植入[18]以及增強(qiáng)上皮細(xì)胞擴(kuò)增相關(guān)信號通路的表達(dá)[19]，但上述方法可能導(dǎo)致上皮細(xì)胞惡性增殖[20]。本研究發(fā)現(xiàn)健脾益腎泄?jié)釡嗄c的含藥血清能修復(fù)人結(jié)腸上皮細(xì)胞間的緊密連接，減輕局部炎癥狀態(tài)，對腸道機(jī)械屏障功能有一定的保護(hù)作用，理論上可延緩CKD進(jìn)展。此外，闡明參與緊密連接調(diào)控的信號通路將有助于發(fā)現(xiàn)新的屏障修復(fù)劑，從而提供更加有效的CKD治療方法。

4 結(jié)論

健脾益腎泄?jié)釡笫蠊嗄c的含藥血清可以增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞活性，增加腸上皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)，可能有助于保護(hù)腸道機(jī)械屏障功能，從而減輕局部炎癥狀態(tài)。