李雪文峰 劉金星 劉鵬飛

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，山東 濟(jì)南 250014；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，山東 濟(jì)南 250014）

卵巢早衰（Premature ovarian Failure，POF）是以閉經(jīng)、雌激素水平降低及不同程度的圍絕經(jīng)期癥狀為臨床表現(xiàn)的疾病，是育齡期女性不孕的主要原因之一，因?yàn)榇萍に厮降南陆担净夹难芗膊?、骨質(zhì)疏松、早期退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。目前西醫(yī)多采用激素替代療法，雖然可以改善患者的臨床癥狀，但停藥后易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期服用可增加患子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。中醫(yī)藥治療POF效果顯著，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討四二五合方治療POF的作用機(jī)制，以期為臨床治療本病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 四二五合方相關(guān)靶點(diǎn)篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，獲取四二五合方各中藥的活性成分，按照口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18的2個(gè)ADME屬性值篩選獲得活性成分及作用的靶點(diǎn)，利用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 卵巢早衰相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以“Premature Ovarian Failure”為關(guān)鍵詞對(duì)OMIM數(shù)據(jù)庫、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫、Genecards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲取POF的靶點(diǎn)。

1.3 四二五合方-卵巢早衰靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 利用Metascape平臺(tái)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，得到四二五合方治療POF潛在的生物過程及相關(guān)通路。利用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建四二五合方藥物成分-卵巢早衰靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 四二五合方活性成分靶點(diǎn)的獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，篩選四二五合方各中藥活性成分，合并后刪除重復(fù)值，共獲得104個(gè)活性成分。

2.2 卵巢早衰相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 從Genecards數(shù)據(jù)庫獲得POF靶點(diǎn)4564個(gè)。在Genecards數(shù)據(jù)庫中，Score值越高代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系越緊密，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，如果靶點(diǎn)過多，則設(shè)置Score大于等于中位數(shù)的靶點(diǎn)作為POF的潛在靶點(diǎn)，第一次取Score中位數(shù)為3.62，第二次取Score中位數(shù)為7.945，設(shè)置Score≥7.945的靶點(diǎn)為POF潛在靶點(diǎn)。結(jié)合OMIM、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫，合并后刪除重復(fù)值，最終得到1822個(gè)POF相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 運(yùn)用Venn對(duì)四二五合方成分靶點(diǎn)與POF靶點(diǎn)取交集，得到共同靶點(diǎn)139個(gè)。將139個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析。結(jié)果顯示，四二五合方治療POF的通路有癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖通路、白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號(hào)通路、麻疹通路、細(xì)胞凋亡通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、瘧疾通路、NF-κB信號(hào)通路等。見圖1。四二五合方參與的生物學(xué)過程（Biological processes，BP）主要包括對(duì)無機(jī)物的應(yīng)答、受傷的應(yīng)答、凋亡信號(hào)通路、對(duì)脂多糖的應(yīng)答等；細(xì)胞成分（Cellular constituent，CC）分析相關(guān)靶點(diǎn)治療卵巢早衰的功能主要富集于膜筏、含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、囊泡腔、蛋白激酶復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體等；分子功能（Molecular function，MF）分析富集基因數(shù)量較大的有蛋白域特異性結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性、蛋白激酶活性等。見圖2。

圖1 四二五合方治療POF靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

圖2 四二五合方治療POF靶點(diǎn)BP、CC、MF富集分析

2.4 四二五合方成分-卵巢早衰靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建四二五合方成分-卵巢早衰靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。圓形節(jié)點(diǎn)為藥物的活性成分，三角形為不同藥物間共有的活性成分，菱形為靶點(diǎn)，正方形為不同的中藥，倒三角形為通路。節(jié)點(diǎn)的面積代表其Degree值，面積越大說明該節(jié)點(diǎn)越重要。見圖3。Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析表明，槲皮素為四二五合方治療POF的主要成分，其次為木犀草素、山柰酚。見表1。

圖3 四二五合方成分-卵巢早衰靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

表1 四二五合方治療POF主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

預(yù)測(cè)PTGS2為四二五合方治療POF的最主要靶點(diǎn)。NCOA2、PGR、HSP90AA1、PTGS1、AR亦為相對(duì)重要的靶點(diǎn)。見表2。

表2 四二五合方治療POF主要靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

3 討論

POF目前在臨床上患病率越來越高，中藥治療POF的效果不劣于甚至優(yōu)于臨床一線西藥，尤其在改善卵巢功能方面潛力極大。張慧珍等[1]通過隨機(jī)對(duì)照研究證實(shí)，四二五合方合甘麥大棗湯比激素替代療法更能改善圍絕經(jīng)期患者的卵巢功能及抑郁癥癥狀。李蘭等[2]通過分析CNKI從建庫至2020年2月收錄的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，POF的病因以腎虛為主，補(bǔ)腎益精法應(yīng)貫穿疾病治療始終。四二五合方中五子衍宗丸補(bǔ)腎填精；四物湯養(yǎng)血和血，精血同源，補(bǔ)血以生精；淫羊藿性溫不燥，補(bǔ)腎壯陽，于陽中求陰；知母瀉相火堅(jiān)腎陰，亦可制約淫羊藿的溫?zé)嶂?，并回歸補(bǔ)腎益陰之本意。全方共奏補(bǔ)腎填精之功效。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步篩選出四二五合方治療POF的活性成分為槲皮素、木犀草素等。槲皮素可以通過增強(qiáng)卵巢組織的抗氧化能力，抑制卵巢的過度氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡。木犀草素可以通過降低凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制POF小鼠卵巢的氧化損傷及細(xì)胞凋亡。四二五合方治療POF的靶點(diǎn)主要集中在PTGS2。PTGS2是前列腺素E2（PGE2）合成的末端限速酶，PGE2是一種介導(dǎo)黃體生成素峰的旁分泌信號(hào)因子，可促進(jìn)卵丘擴(kuò)張、卵母細(xì)胞成熟及卵泡破裂等生物過程，PTGS2可促進(jìn)PGE2的合成，促進(jìn)排卵過程的發(fā)生[3]。

四二五合方治療POF與IL-17信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、HIF-1信號(hào)通路密切相關(guān)。Th17可以通過釋放炎癥因子IL-17促進(jìn)免疫，Treg細(xì)胞可以抑制免疫，在自身免疫性POF中存在Th17/Treg細(xì)胞比失衡及血清IL-17水平上升。改善Th17/Treg細(xì)胞比失衡及降低血清IL-17水平可以改善卵巢功能?；熕幬?、氧化應(yīng)激、放療可以通過上調(diào)凋亡分子表達(dá)、下調(diào)抗凋亡分子的表達(dá)，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡，放療還可以通過誘導(dǎo)垂體腺細(xì)胞凋亡，下調(diào)FSH和LH表達(dá)，減弱對(duì)卵泡發(fā)育的刺激，引起POF。氧化損傷可使卵泡質(zhì)量下降，最終導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備功能減退。HIF-1可以參與許多低氧反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)能力，減少因缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。HIF-1可激活促紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF，激發(fā)調(diào)節(jié)血管生成、紅細(xì)胞生成的作用，并能參與FSH誘導(dǎo)的卵泡血管的生成，為卵泡的發(fā)育提供氧氣、營(yíng)養(yǎng)及促性腺激素[4]。持續(xù)的炎癥會(huì)使耗氧量增加，導(dǎo)致炎癥組織內(nèi)局部缺氧，缺氧的炎癥環(huán)境會(huì)使細(xì)胞內(nèi)HIF-1的水平增加，累積的HIF-1可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化、抑制Treg細(xì)胞分化、減少中性粒細(xì)胞的凋亡，增加炎癥的持久性，由此推測(cè)HIF-1對(duì)自身免疫性POF的發(fā)生發(fā)展有一定促進(jìn)作用[5]。綜上，四二五合方可能通過細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激途徑來治療POF。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及文獻(xiàn)查閱，發(fā)現(xiàn)四二五合方可以多成分、多靶點(diǎn)、多通路聯(lián)合作用于POF，但由于中藥成分在煎煮時(shí)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜性，本研究未將四二五合方煎煮后的化學(xué)成分以及四二五合方活性成分在體內(nèi)的代謝物納入分析。但可以確定四二五合方可通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療POF，其具體機(jī)制還需要開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。