白海娜

（吉林化工學院 生物與食品工程學院，吉林吉林 132022）

沒食子酸（Gallic Acid，GA）是一種天然的多酚化合物，是大多數(shù)植物中存在的次級代謝產物。沒食子酸廣泛存在于堅果、茶、葡萄、不同漿果、石榴、芒果和漆樹等植物中，具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗癌等作用[1-4]，在醫(yī)藥、食品、涂料、有機合成等領域有廣泛的應用價值[5-6]。研究證實，沒食子酸在生物體內能夠有效清除羥基自由基和黃嘌呤氧化酶自由基，從而抑制人肝微粒體細胞色素P4503A介導的氧化作用，減少組織中活性氧的堆積，發(fā)揮其在體內的抗氧化作用[7-8]。沒食子酸在生物體內有氧化作用，能抑制小鼠紅細胞的溶血活性[9]。沒食子酸對大腸桿菌有應激抑制作用，XU等[10]通過總結發(fā)酵特征和轉錄分析，闡明了大腸桿菌3110對沒食子酸反應的生理機制。與對照組（無應激）相比，在高濃度的沒食子酸應激情況下，細胞生長嚴重滯后，出現(xiàn)不規(guī)則的細胞形態(tài)。大腸桿菌的葡萄糖消耗量隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中沒食子酸含量的增加而相繼減少。沒食子酸因具有抗氧化作用被作為抗氧化劑應用于食品等相關行業(yè)[11-12]，其兼有的抗菌、抗炎等生理功能使其在提高動物生產性能和改善動物健康狀況方面已有較多研究[13-16]。本文通過測定酵母細胞的生長曲線，選取對數(shù)期酵母細胞進行毒性實驗，采用平板菌落計數(shù)法，研究沒食子酸對酵母細胞的毒性作用及其對紫外氧化損傷酵母細胞的保護作用，以期為其在抗氧化劑的應用方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

酵母菌，安琪牌高活性干酵母活化而得；沒食子酸，中國醫(yī)藥集團有限公司；無水葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、瓊脂粉、蛋白胨，阿拉丁試劑有限公司；酵母膏，天津市凱信化學工業(yè)有限公司。

1.2 儀器

高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、恒溫水浴搖床、紫外光光度計、超凈工作臺、離心機和生物恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 實驗方法

1.3.1 YPD或YEPD培養(yǎng)基

①液體培養(yǎng)基配制。將10 g酵母膏，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖溶于1000 mL水中，在115 ℃下滅菌 20 min。②固體培養(yǎng)基配制。取部分液體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉，在115 ℃下滅菌20 min。

1.3.2 酵母菌生長曲線

（1）酵母菌活化。在無菌條件下，將1%酵母粉末加入滅菌后的5%葡萄糖溶液中。置于28 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)（轉速200 r·min-1）活化3 h。

（2）酵母菌的YEPD液體培養(yǎng)。按1%比例將酵母菌液轉移到新培養(yǎng)基中，置于28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)（轉速200 r·min-1）5 h，將酵母培養(yǎng)至對數(shù)期，可冷藏保存。

（3）酵母菌的生長曲線。從搖晃均勻后的酵母菌YEPD液體培養(yǎng)基中無菌取出菌液，加入到滅菌過的新鮮YEPD液體培養(yǎng)基中，每間隔2 h測定吸光度數(shù)值，最終測得24 h的吸光度，用稀釋后的混合液吸光度乘以相應的稀釋倍數(shù)得吸光度數(shù)值。以接種后 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h和24 h為橫坐標，以吸光度乘以相應稀釋倍數(shù)為縱坐標，最終繪制出酵母細胞24 h的生長曲線。

1.3.3 沒食子酸對酵母細胞的毒性實驗

（1）收集菌體。將培養(yǎng)至對數(shù)期的酵母菌菌液置于離心管中，然后用離心機4000 r·min-1離心5 min，倒掉上清液，收集菌體。用磷酸鹽緩沖液（pH=6.9）洗1～2次，并再次加入磷酸緩沖液得酵母菌懸液。

（2）正常對照組。取最終稀釋搖勻后的菌液 1.9 mL再加入0.1 mL磷酸緩沖液為正常對照組，分別移取100 μL于3個平行固體YEPD培養(yǎng)基中。

（3）樣品組。取最終稀釋搖勻后的菌液1.9 mL再加入0.1 mL的沒食子酸樣品為樣品組，確定6組沒食子酸終濃度分別為GA-1（6.25 μg·mL-1）、GA-2（12.50 μg·mL-1）、GA-3（25.00 μg·mL-1）、GA-4 （50.00 μg·mL-1）、GA-5（100.00 μg·mL-1）和GA-6（200.00 μg·mL-1）。

（4）細胞培養(yǎng)。將最終涂布好的所有培養(yǎng)皿放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，菌落計數(shù)。酵母細胞存活率的計算公式為

式中：Ai為實驗組酵母單菌落數(shù)；Aj為空白組酵母單菌落數(shù)；A0為對照組酵母單菌落數(shù)。

1.3.4 沒食子酸對紫外損傷酵母細胞的保護作用

取正常對照組以及樣品組4種混合溶液各 2 mL，在致死條件（紫外燈的功率20 W，樣品距離光源30 cm，照射時間60 s）下進行紫外照射處理，每種樣品各取100 μL分別涂布于YEPD固體培養(yǎng)基上。將一定濃度的酵母細胞均勻涂布在平板培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，菌落計數(shù)。按式（1）計算酵母細胞存活率。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的生長曲線

單細胞微生物的生長過程通常分為4個階段，即適應期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。由圖1知，酵母菌的生長曲線清晰地反映了酵母菌的4個生長階段，初始階段0～5 h為酵母菌生長的遲滯期； 5～14 h的生長曲線呈大幅上升趨勢，酵母菌經過短暫的適應期后快速生長，開始大量繁殖，發(fā)酵速度明顯加快，菌種數(shù)量增多，說明酵母菌進入了生長對數(shù)期；14～22 h產生大量的次生代謝產物使得pH值下降，酵母菌生長環(huán)境惡劣，此時生長速度下降，酵母細胞的對數(shù)生長階段結束進入穩(wěn)定生長階段，活菌數(shù)目變化不大，培養(yǎng)22 h后酵母菌的數(shù)量達到峰值。22 h以后，酵母菌的生長呈緩慢的下降趨勢，是酵母菌生長的衰亡期。

圖1 酵母菌的生長曲線

綜上可知，此高活性酵母的對數(shù)期在5～14 h。在酵母細胞穩(wěn)定期，酵母細胞的生長速率和死亡速率達到基本平衡，此時酵母細胞的總體個數(shù)保持基本不變，所以不適合測定。而在對數(shù)生長期酵母的生長速率遠遠大于死亡速率，以最快速度進行繁殖，此時的酵母菌細胞活性旺盛，細胞個體形態(tài)及生理指標都較為穩(wěn)定，所以本實驗選取酵母為對數(shù)期酵母。

2.2 沒食子酸對酵母細胞的毒性實驗

為了評估沒食子酸對酵母菌細胞的毒性，采用不同濃度的沒食子酸處理酵母菌。在2.1的基礎上，選取對數(shù)生長期的酵母細胞，沒食子酸終濃度分別為6.25 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1、25.00 μg·mL-1、 50.00 μg·mL-1、100.00 μg·mL-1和200.00 μg·mL-1的6組樣品組以及正常組對照組，在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，對YEPD固體培養(yǎng)基上酵母菌的菌落進行計數(shù)，得出沒食子酸對酵母細胞的毒性結果，如表1所示。

表1 沒食子酸對酵母細胞的毒性作用

由表1可知，沒食子酸處理的樣品組除了最高濃度GA-6（200.00 μg·mL-1），其余組的細胞相對存活率均超過90%，因此可以判斷GA-6對酵母細胞產生毒性作用，其余組沒有對酵母菌細胞的存活率造成影響。且已經有大量的研究證明沒食子酸對正 常細胞沒有毒性。因此，選擇濃度為25.00 μg·mL-1、 50.00 μg·mL-1、100.00 μg·mL-1的沒食子酸進行對紫外損傷酵母細胞的保護作用研究。

2.3 沒食子酸對紫外損傷酵母細胞的保護作用

目前使用紫外線輻照酵母菌細胞是比較常用的評價化合物細胞抗氧化活性的模型之一，紫外線易造成細胞損傷凋亡，對比模型組與正常組，發(fā)現(xiàn)酵母細胞明顯減少；再將模型樣品組與模型組對照，酵母細胞有所增加。結果如表2所示。

紫外線處理過的細胞存活率明顯降低。與紫外線模型組相比，采用50 μg·mL-1的沒食子酸對細胞進行預處理可以明顯提高酵母菌細胞的存活率，增加了15.89個百分點，使用濃 度為100 μg·mL-1的沒食子酸對細胞進行預處理，存活率增加了9.58個百分點。然而，使用濃度為25 μg·mL-1的沒食子酸對細胞進行預處理后，其存活率與模型組相比增加了4.38個百分點，沒有顯著改變紫外線損傷過的酵母菌細胞存活率。這些結果表明，沒食子酸可以增強紫外線誘導酵母細胞氧化損傷的保護作用。使用 50 μg·mL-1，100 μg·mL-1的沒食子酸溶液對細胞進行預處理，可以有效保護細胞抵抗紫外線照射的損傷。

表2 沒食子酸對紫外氧化損傷酵母細胞的保護作用

3 結論

本研究通過建立紫外線誘導酵母菌細胞氧化損傷模型，研究沒食子酸對酵母細胞氧化損傷的保護作用，先通過繪制酵母菌的生長曲線，確定了酵母菌細胞的4個生長階段，確定酵母菌細胞培養(yǎng)5 h進入生長對數(shù)期。此外，50 μg·mL-1沒食子酸溶液預處理對紫外氧化損傷酵母細胞具有明顯的保護作用，為沒食子酸作為抗氧化劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。