宋 楊，于 明

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種表現(xiàn)為認(rèn)知功能減退的神經(jīng)退行性病變，其病程長、治療費用高，給病人家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[1]。然而，AD病因迄今未明，發(fā)病機制學(xué)說亦多[2]。尋找AD特異性標(biāo)志物及研究其機制仍是對AD早發(fā)現(xiàn)、早診療的有效手段。 microRNAs(miRNAs)是一類長為19～22 bp的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA[3]，與包括AD在內(nèi)的許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[4]，因而也具有作為AD早期診斷的生物標(biāo)志物的潛能。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫獲取AD相關(guān)miRNAs芯片數(shù)據(jù)集，使用在線工具GEO2R分析差異表達的miRNAs，并選取明顯高表達的 miR-182-5p進一步驗證。此外，本研究使用生物信息學(xué)對miR-182-5p進行系統(tǒng)的靶基因預(yù)測及功能分析，以期為深入研究其具體作用機制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 miRNA芯片數(shù)據(jù)集 在GEO數(shù)據(jù)庫搜索框中以“miRNA and Alzheimer′s disease”為檢索詞，搜索并獲得miRNA與AD相關(guān)的數(shù)據(jù)集GSE104514，該數(shù)據(jù)集包含12對野生型(對照組)和AD模型小鼠樣本。隨后，選擇芯片平臺GPL16759，利用GEO2R工具分析差異表達的miRNAs，選取差異最大(|logFC|最大)的miR-182-5p作進一步驗證和分析。

1.2 臨床資料 收集2019年5月至2020年2月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的AD病人(AD組)28例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2011年美國神經(jīng)病學(xué)及相關(guān)疾病協(xié)會(NINCDS-ADRDA) 提出的“很可能的AD癡呆”的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)臨床癡呆評定量表(CDR)評分≥1分；(3)頭顱CT示腦萎縮、腦室擴大，MRI有雙側(cè)顳葉、海馬萎縮的證據(jù)支持AD的診斷，且除外腦血管病、占位及其他異常信號。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他原因?qū)е碌陌V呆，如腦血管病相關(guān)疾病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、路易體癡呆、額顳葉癡呆等引起的認(rèn)知功能障礙；(2)嚴(yán)重的其他系統(tǒng)疾病，如精神疾病、腫瘤、風(fēng)濕免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重的肝腎功能不全、其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腦器質(zhì)性疾病、顱腦外傷、嚴(yán)重過敏體質(zhì)等；(3)不能配合者；(4)有其他不適宜入選的情況。AD組病例平均(72.9±9.1)歲，其中男11例，女17例。另招募年齡及性別相符的同期體檢健康者 15 名(對照組)，其中男6名，女9名，平均(69.1±8.6)歲。2組年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有受試者或其家屬均簽署知情同意書。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會審查批準(zhǔn)。

1.3 miR-182-5p表達水平的檢測 使用抗凝管采集研究對象空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血4～5 mL靜脈，離心后收集上清液，參照康為世紀(jì)公司 RNApure Circulating Reagent、HiFiScript gDNA Removal RT Mastermix說明書提取總RNA及逆轉(zhuǎn)錄。用實時熒光定量聚合鏈反應(yīng)酶(qPCR)法檢測2組血清中miR-182-5p的表達水平，2-ΔΔCt算法進行相對定量分析。上海生物工程技術(shù)有限公司設(shè)計合成的熒光定量PCR引物序列如下：U6內(nèi)參引物，上游引物:5′-GGA ACG ATA CAG AGA AGA TTA GC 3′，下游引物:5′-TGG AAC GCT TCA CGA ATT TGC G 3′；miR-182-5p引物，上游引物:5′-GCG CGT GGT TCT AGA CTT GC 3′，下游引物:5′-ATC CAG CTT GC 3′。

1.4 miR-182-5p保守性分析 miRbase(http://www.mirbase.org/)是由曼徹斯特大學(xué)研究人員開發(fā)的一個開放的miRNA注釋信息數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫中收錄了來自200多個物種，近4萬個miRNA的信息，是最全面的miRNA數(shù)據(jù)庫[6]。本研究運用miRBase數(shù)據(jù)庫查找 miR-182-5p 在不同物種間的成熟體序列并分析其保守性。

1.5 miR-182-5p靶基因預(yù)測 通過TargetScanversion7.2 (http://www.targetscan.org/ver_72/)數(shù)據(jù)庫[7]、miRDB (2016)(http://mirdb.org)數(shù)據(jù)庫[8-9]、miRcode數(shù)據(jù)庫(http://www.mircode.org/index.php)和miRWalk數(shù)據(jù)庫(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)預(yù)測 miR-182-5p 靶基因，對4個數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果取交集，使預(yù)測結(jié)果更具可靠性。

1.6 miR-182-5p靶基因功能和通路富集分析 應(yīng)用DAVID version 6.8(https://david.ncifcrf.gov)和KOBAS version 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)在線數(shù)據(jù)庫對miR-182-5p靶基因進行GO功能和KEGG通路富集分析，以P<0.05為界值對富集結(jié)果進行篩選。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t(或t′)檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 miR-182-5p在AD模型小鼠中高表達 GSE104514芯片數(shù)據(jù)來自12只AD模型小鼠(Tg)和12只野生型小鼠(wild)的全腦組織或大腦皮層。根據(jù)P<0.05和| logFC |>1篩選獲得6個差異表達miRNAs，其在小鼠的表達水平見圖1。其中，miR-182-5p在模型小鼠大腦組織中為差異倍數(shù)最大且唯一上調(diào)的miRNA(見表1)，因此選擇miR-182-5p并對其進行深入分析。

表1 miRNAs表達水平的差異

2.2 miRNA表達量 應(yīng)用qPCR檢測AD組和對照組血清中 miR-182-5p的表達水平，結(jié)果顯示，AD病人血清中的miR-182-5p表達量為2.022±1.225,高于對照組中miR-182-5p表達量0.486±0.442，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t′=5.95，P<0.01)。

2.3 miR-182-5p 在不同物種間高度保守 通過miRBase 數(shù)據(jù)庫比較miR-182-5p在不同物種間的成熟體序列，結(jié)果顯示miR-182-5p的序列在人(Homosapiens)、家雞(Gallusgallus)、豚鼠(Caviaporcellus)等10個物種中高度相似，表明miR-182-5p在不同物種間具有高度的保守性(見表2)。

表2 不同物種間miR-182-5p的序列比較

2.4 miR-182-5p 潛在靶基因 運用miRcode、miRDB、miRWalk和Target Scan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-182-5p的下游靶基因，分別獲得281、1 266、6 475、1 325個，結(jié)果取交集，共得到 23個靶基因(見圖2)，23個交集靶基因(見圖3)。

2.5 miR-182-5p靶基因功能的富集分析 首先，應(yīng)用 DAVID version 6.8(https://david.Ncifcrf.gov)數(shù)據(jù)庫對miR-182-5p交集靶基因進行基因ID轉(zhuǎn)換，隨后將轉(zhuǎn)換后的基因ID輸入KOBAS version3.0 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/)分析平臺，對 23個交集靶基因行GO和KEGG富集分析，以P<0.05作為篩選界值。GO富集結(jié)果顯示，miR-182-5p靶基因主要參與于鋅離子的結(jié)合(zinc ion binding)、生物過程的負(fù)調(diào)控(negative regulation of biological process)、雜環(huán)類化合物的結(jié)合(heterocyclic compound binding)、主要代謝過程的調(diào)節(jié)(regulation of primary metabolic process)、gtpase的活性(GTPase binding)、膜的內(nèi)在成分的組成(intrinsic component of membrane)、大腦的發(fā)育(brain development)、部分細(xì)胞形態(tài)的發(fā)生(cell part morphogenesis signaling)、轉(zhuǎn)移酶的活性(transferase activity)、信號的調(diào)節(jié)(regulation of signaling)、泛素結(jié)合酶的結(jié)合(ubiquitin conjugating enzyme binding)、耳蝸的發(fā)育(cochlea development)、組蛋白h4-k16的乙?；饔?histone H4-K16 acetylation)、咽系統(tǒng)的發(fā)育(pharyngeal system development)、神經(jīng)元演化方向的規(guī)范(cerebral cortex cell migration)、大腦皮層細(xì)胞的遷移(cerebral cortex cell migration)、大腦皮層細(xì)胞的放射狀定向遷移(cerebral cortex radially oriented cell migration)等多個生物學(xué)過程。前20個GO功能項見表3與圖4。而KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，這些靶基因主要參與腎集合管的酸的分泌(collecting duct acid secretion)，醚脂類的代謝(ether lipid metabolism)，志賀菌病的致病過程(shigellosis)，細(xì)胞黏膜的黏附(adherens junction)，細(xì)菌對上皮細(xì)胞的侵襲(bacterial invasion of epithelial cells)等通路(見表4、圖5)。

表3 miR-182-5p靶基因GO分析結(jié)果

表4 miR-182-5p靶基因KEGG分析結(jié)果

3 討論

AD在所有類型的癡呆中最為常見，屬于神經(jīng)退行性變的一種，其早期癥狀常表現(xiàn)為記憶力減退，以近事遺忘為主，隨疾病發(fā)展可出現(xiàn)認(rèn)知障礙、行為癥狀及其他精神癥狀[10]。AD主要的病理學(xué)特征包括β淀粉樣蛋白的沉積，神經(jīng)原纖維纏結(jié)[11]等。盡管AD的神經(jīng)病理學(xué)特征已被公認(rèn)，然而，其病因尚未完全明確[12]。目前，臨床上對AD的早期診斷、治療仍存在困難[13]。研究表明miRNAs是AD潛在的生物標(biāo)志物及治療靶點，例如SMITH等證明miR-132直接靶向tau mRNA來調(diào)節(jié)其表達，從而調(diào)控AD的疾病進程[14]；LI等[15]證實miR-219-5p缺失介導(dǎo)的 TTBK1和GSK-3表達上調(diào)可能是促進tau蛋白磷酸化和AD進展的機制。

miR-182-5p的成熟體序列在多個物種間呈現(xiàn)高度保守，提示miR-182-5p在物種進化中具有重要作用。此外，許多研究表明miR-182-5p在多種腫瘤中異常表達，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，研究[16]顯示miR-182-5p在膀胱癌病人組織和細(xì)胞系中明顯下調(diào)，而miR-182-5p上調(diào)可抑制Cofilin 1的表達進而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及體外腫瘤形成，表明miR-182-5p與膀胱癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可作為膀胱癌的潛在生物標(biāo)志物。miR-182-5p與非腫瘤疾病相關(guān),例如，有研究[17]表明miR-182-5p在局部侵襲性牙周炎病人外周血細(xì)胞中顯著上調(diào)，與病人免疫高反應(yīng)性相關(guān)。本次通過搜集GEO數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)中AD相關(guān)數(shù)據(jù)集并進行分析，結(jié)果顯示AD小鼠相較于野生小鼠明顯高表達miR-182-5p，提示miR-182-5p與AD發(fā)病可能密切相關(guān)。隨后，我們進一步通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)證實相較于健康人，AD病人血清中的miR-182-5P明顯高表達(P<0.01)，表明miR-182-5p高表達可促進AD發(fā)生發(fā)展。

然而，miR-182-5p在AD中的作用機制尚不清楚。本研究進一步通過生物信息分析方法預(yù)測獲得23個miR-182-5p的潛在靶基因，可為深入探討miR-182-5p在AD發(fā)病中的具體機制提供依據(jù)。隨后，我們對其靶基因進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析，結(jié)果顯示靶基因主要涉及大腦的發(fā)育，大腦皮層細(xì)胞遷移、大腦皮層細(xì)胞放射狀定向遷移等，提示miR-182-5p可能通過多種途徑參與AD發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，本研究證實了miR-182-5p在AD病人中明顯高表達，分析了miR-182-5p靶基因及其靶基因的功能和相關(guān)通路，可為進一步通過熒光素酶報告、體內(nèi)體外實驗等驗證miR-182-5p在AD中的作用機制提供理論依據(jù)，也可能為更準(zhǔn)確地闡明miR-182-5p在AD中的功能及早期診斷、分型和治療提供幫助。