秦春曉，李 瑩，張詠雪，戴紹軍

（1.東北林業(yè)大學生命科學學院東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040；2.上海師范大學生命科學學院上海植物種質資源工程技術研究中心，上海200234）

溶解素基序（LysM）一般由42～48個氨基酸殘基組成，N端的16個氨基酸和C端的10個氨基酸相對保守［1］，含有對稱的βααβ的拓撲結構，其中兩個α螺旋位于雙鏈反向平行的β折疊一側［2］.除古細菌外，幾乎所有生物都具有含LysM的蛋白質，且多為分泌蛋白或膜蛋白［3］.含LysM的植物受體激酶可以識別或感應共生菌并誘導其對真菌的抗性［4］.根據(jù)蛋白是否含有激酶結構域，LysM家族蛋白分為兩類，包括LysM受體類蛋白（LYP）和LysM受體激酶（LYK）［2］，都在植物免疫應答中具有重要作用.

1 水稻LysM蛋白參與幾丁質應答

水稻幾丁質激發(fā)子結合蛋白（CEBiP）胞外具有2個LysM結構域和1個跨膜域，是首個被鑒定的真菌幾丁質觸發(fā)子結合的多糖受體，在感知幾丁質觸發(fā)子和信號轉導中發(fā)揮作用.敲除OsCEBiP基因的水稻植株，幾丁質誘導的活性氧（ROS）爆發(fā)和下游幾丁質響應基因被嚴重抑制［5］.此外，OsCERK1（chitin elicitor receptor kinase）含有1個LysM結構域、1個跨膜域和1個胞內激酶功能域，對水稻幾丁質信號轉導至關重要.敲低OsCERK1也會顯著抑制幾丁質誘導的防御反應.雖然OsCERK1不具有直接結合殼聚糖的能力.但在感知到幾丁質寡糖信號后，OsCEBiP和OsCERK1會迅速形成異源二聚體，激活下游信號以進行防御反應［6］.此外，在水稻中OsLYP4和OsLYP6均含有LysM，作為感受細菌肽聚糖（PGN）和幾丁質的共受體發(fā)揮作用，兩者可以形成同源和異源二聚體，并與OsCEBiP相互作用，參與幾丁質感知與信號轉導過程［7］.

感 知 到 幾 丁 質 后，OsCERK1與OsRacGEF1（guanine nucleotide exchange factors）互 作 并 將OsRacGEF1的C末端S549磷酸化，進而OsRacGEF1作為OsRac1的鳥嘌呤核苷酸交換因子激活OsRac1［8］，隨后OsRac1與OsMAPK3/6（mitogen-activated protein kinase）互作并將其激活［9］.同時，OsCERK1與多種類受體胞質激酶（RLCK）互作.質膜上OsCERK1的激酶結構域與OsRLCK185互作并將其磷酸化［10］，進而OsRLCK185磷酸化OsMAPKKKε C末端調控域，從而級聯(lián)磷酸化OsMAPKK4和MAPK3/6［11］，激活MAPK級聯(lián)信號通路.OsMAPK3/6可以磷酸化bHLH轉錄因子OsRAI1，調節(jié)幾丁質誘導基因OsPAL1和OsWRKY19的轉錄水平［9，12］，啟動植物免疫應答反應.此外，OsCERK1也可以調控其他類受體胞質激酶，如OsRLCK57，OsRLCK107，OsRLCK118和OsRLCK176等，參與幾丁質信號轉導［13-15］，如圖1（a）所示.

2 擬南芥LysM蛋白參與免疫應答

擬南芥基因組共編碼5個LYK，包括LYK1/CERK1和LYK2～LYK5［16-17］.擬南芥AtCERK1含有3個LysM結構域、1個跨膜域和1個胞內激酶域［18］.與OsCERK1不同，AtCERK1可以直接與幾丁質結合［19］，AtCERK1胞外的3個LysM結構域都是幾丁質結合所必需的，任何一個LysM結構域缺失都會破壞其穩(wěn)定的空間結構［20］.胞外的幾丁質、幾丁質寡聚體和殼聚糖與LysM結構域結合，導致AtCERK1同源二聚化，進而激活AtCERK1胞內近膜和激酶結構域的多個氨基酸快速磷酸化［20-21］.保守的跨膜結構域中C端近膜區(qū)（部分序列）也調節(jié)AtCERK1激酶活性，參與幾丁質信號轉導［22］.AtCERK1對幾丁質的識別具有特異性，cerk1突變體中，幾丁質觸發(fā)的ROS爆發(fā)、MAPK級聯(lián)反應，以及幾丁質響應基因的表達等幾乎都喪失了［18，23］.然而，AtCERK1對幾丁質的親和力相對較低.將AtCERK1幾丁質結合位點A138突變?yōu)镠并未阻斷AtCERK1自磷酸化，這表明雖然AtCERK1是響應幾丁質必需的，但是還有其他蛋白參與幾丁質結合，并與AtCERK1互作共同激活下游信號通路［22］.擬南芥中的AtLYK4和AtLYK5可能具有這樣的作用［24-25］.AtLYK4可以識別幾丁質，作為AtCERK1的共受體增加其幾丁質親和性和激酶活性［24］.在lyk4突變體中，受幾丁質誘導的基因轉錄水平下降，胞內鈣離子（Ca2+）濃度增加受抑制，但其表型不如cerk1突變體明顯［26］.此外，AtLYK5也是幾丁質的主要受體，與AtCERK1形成幾丁質誘導復合物，是幾丁質誘導AtCERK1形成同源二聚體和磷酸化所必需的.AtLYK5與幾丁質的親和力比AtCERK1高很多，lyk5-2突變體對幾丁質反應顯著降低，缺乏ROS爆發(fā)表型.將點突的AtLYK5（AtLYK5S206P和AtLYK5Y128G）回補到lyk5-2突變體中，無法恢復其表型；LYK5S206P不與幾丁質結合，而AtLYK5Y128G與幾丁質結合能力下降，這表明S206和Y128是AtLYK5調控幾丁質結合的關鍵位點［25］.AtLYK4與AtLYK5的胞外域可以相互作用形成同源二聚體.幾丁質誘導AtCERK1與AtLYK4，AtLYK5形成復合物［27］.正常狀態(tài)下，AtCERK1，AtLYK4和AtLYK5均定位于質膜［28］；幾丁質觸發(fā)后，磷酸化的AtCERK1仍停留在質膜上，而AtLYK5受到誘導而內化.然而，在cerk1或AtCERK1蛋白活性降低的突變植株中，沒有發(fā)現(xiàn)幾丁質誘導的AtLYK5內吞作用［28］.

擬南芥免疫應答過程中，AtCERK1介導的信號轉導通路可能包括類受體胞質激酶AtBIK1（botrytisinduced kinase 1），AtBAK1（BRI1-associated receptor kinase 1），AtPBL1（BIK1-like protein kinase），AtPBL27和RLCKⅦ-4等組分.AtCERK1與AtBIK1互作并將其磷酸化［29］，AtBIK1能與AtBAK1互作［30］.AtBIK1和AtPBL1對幾丁質誘導的胼胝質積累起作用，AtBIK1與過氧化氫（H2O2）積累也相關［29］.相比于AtBIK1，AtCERK1可以優(yōu)先磷酸化AtPBL27，AtCERK1的磷酸化位點S493突變不影響其自磷酸化活性，卻降低AtPBL27的轉磷酸化水平，從而影響幾丁質信號感知與轉導的起始階段［31］.擬南芥AtPBL27是水稻OsRLCK185的同源蛋白，可以磷酸化AtMAPKKK5，激活AtMKK2，AtMKK4和AtMKK5的磷酸化［32］，進而調節(jié)AtMAPK3/6［33］，調控相關防御基因（AtNit4和AtWRKY75）表達［33］.AtPBL27和AtMAPKKK5也參與幾丁質誘導的胼胝質沉積［32-33］.AtCERK1也可以磷酸化RLCKⅦ-4，進而激活MAPK級聯(lián)反應，啟動免疫應答［34］，如圖1（b）所示.此外，受細菌病原體誘導后，AtBAK1可以與AtCERK1互作，磷酸化AtCERK1的近膜區(qū)，增強植株真菌抗性［35］.

3 擬南芥LysM蛋白免疫應答中的負調控機制

LysM蛋白響應幾丁質的免疫過程也受到負調節(jié)因子的調控，從而保護植物生長免受幾丁質誘導的持續(xù)性的免疫損傷［36］.目前，對此方面的認識僅僅局限于擬南芥AtCERK1相關的負調控研究.

AtCERK1調節(jié)的免疫過程可能受到蛋白質可逆磷酸化的調控.在感知幾丁質信號后，AtCERK1會募集其互作蛋白PP2C絲/蘇氨酸磷酸酶（CIPP1），使AtCERK1的Tyr428去磷酸化，AtCIPP1會與去磷酸化的AtCERK1解離，進而AtCERK1的Tyr428再發(fā)生自磷酸化并恢復待命（standby）狀態(tài)［37］.此外，AtCERK1與富含亮氨酸重復的類受體激酶（LRR-RLK）LIK1互作并將其直接磷酸化，負調節(jié)幾丁質觸發(fā)的免疫過程［38］.幾丁質處理后，lik1突變體植株會產(chǎn)生更多的ROS，AtMAPK3和AtMAPK6磷酸化水平顯著增加，這表明AtCERK1磷酸化AtLIK1會抑制下游的信號通路，但對其分子調控機制并不清楚［38］，如圖1（c）所示.

依賴或不依賴泛素連接酶U-box蛋白介導的蛋白質降解途徑都可能對AtCERK1活性具有負調控作用.AtCERK1磷酸化的胞內激酶結構域與泛素連接酶U-box蛋白12或13（PUB12/13）的ARM結構域相互作用［36］，這表明幾丁質激活AtCERK1的自磷酸化是其與AtPUB12/13相互作用的關鍵.pub12，pub13突變體幾丁質誘導的ROS爆發(fā)、MAPK激活和胼胝質沉積等一系列免疫反應增強［36］.這暗示著AtPUB12和AtPUB13參與了幾丁質受體復合物的負調控作用，這種負調控是否是通過泛素化AtCERK1介導其降解有待進一步研究.有意思的是，AtCERK1也可以與AtPUB4相互作用.從pub4突變體表型上看，PUB4正調節(jié)幾丁質誘導的ROS產(chǎn)生和胼胝質沉積，負調節(jié)MAPK激活與防御基因表達，這種看起來相互矛盾的表型可能是pub4突變引用的水楊酸（SA）合成紊亂有關，但具體機制尚不清楚［39］.而AtCERK1的磷酸化位點S493突變會降低AtPUB4的轉磷酸化水平［31］.此外，AtCERK1可以與RLCKⅦ-4家族中的組成型差異生長蛋白1（CDG1）互作并將其磷酸化.AtCDG1獨立于PUB12/13途徑來促進AtCERK1降解，進而負調節(jié)免疫反應.但該過程需要具有激酶活性的AtMEKK1參與，失活的AtMEKK1可以抑制AtCDG1介導的AtCERK1降解和免疫缺陷［40］，如圖1（c）所示.

圖1 植物LysM蛋白參與幾丁質激活免疫反應通路.

4 LysM蛋白在其他植物免疫應答中的作用

含LysM的蛋白在不同植物中也參與多種生物學功能.如在感知幾丁質和信號傳導過程中，雖然AtLYK2有助于誘導胼胝質沉積，但是其作用并不明顯.但AtLYK2會增強由鞭毛蛋白誘導的灰霉病菌和丁香假單胞菌的抗性，以及在真菌感染過程中激活防御基因的表達［41］.

棉花GhLYK1和GhLYK2具有結合幾丁質的能力，受大麗輪枝菌感染后被誘導，對棉花抗黃萎病有一定的作用［42］.棉花GhLYP1，GhLYK7和細胞外LysM蛋白3（GhLysMe3）是識別幾丁質信號的受體，可激活下游SA、茉莉酸（JA）和ROS信號通路，以及相關防御基因的表達，增強對黃萎病的抗性［43］.細胞壁相關激酶GhWAK7A直接與GhCERK1和GhLYK5相互作用［44］.被真菌病原菌感染后，GhLYK5識別幾丁質，刺激GhLYK5與GhCERK1結合.GhWAK7A對GhLYK5的磷酸化或起支架（scaffolding）作用，可能促進GhLYK5與GhCERK1復合物的形成，從而啟動下游ROS產(chǎn)生、MAPK激活和防御相關基因表達，提高黃萎病和枯萎病抗性［44］.

在桑樹中鑒定了MmLYP1（CEBiP同源物）和MmLYK2（CERK1同源物）.用幾丁質處理后，MmLYP1的表達顯著上升，但MmLYK2沒有明顯變化.此外，MmLYP1對不溶性幾丁質聚合物具有親和力，而MmLYK2的親和能力較低.這表明雖然MmLYP1缺乏胞內激酶結構域，但MmLYP1通過與MmLYK2相互作用參與幾丁質信號轉導［45］.

在番茄中，SlLYK1參與幾丁質誘導的免疫反應，SlLYK10和SlLYK12參與調節(jié)叢枝菌根（AM）共生，而異源過表達SlLYK1和SlLYK13將誘導細胞死亡［46-47］.

5 結論與展望

LysM結構域作為一類古老并廣泛存在的結構域，在植物免疫應答過程中起作用.LysM蛋白介導的植物免疫途徑的調控機制已經(jīng)取得了顯著進展，但LysM蛋白對不同聚糖結構的特異性識別機制仍不清楚，其激酶可逆磷酸化與泛素化調節(jié)的蛋白質周轉機制也有待研究.進一步挖掘免疫應答過程中LysM蛋白調控的下游因子并明確關鍵調控位點，解析LysM家族成員之間及其與其他膜定位類受體激酶在質膜上的招募與互作分子機制，明確LysM與其互作蛋白形成的分子模塊對下游靶蛋白的調控作用，將為深入揭示LysM蛋白對植物免疫應答的分子調控機理提供重要信息.