宋春燕，王 琪，單壹壹，李丹丹，于 晶

（上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

0 引言

苔蘚植物是一類獨(dú)特的高等植物類群，其形態(tài)結(jié)構(gòu)矮小，有莖和葉的分化，莖葉一般由單層或少數(shù)幾層細(xì)胞構(gòu)成，體表無蠟質(zhì)的角質(zhì)層，或角質(zhì)層不發(fā)達(dá)，無維管束組成的輸導(dǎo)組織，無真正的根，其根稱之為“假根”，僅具有吸附作用［1］.苔蘚植物營養(yǎng)物質(zhì)來自莖葉體表吸收，對環(huán)境變化特別敏感，獨(dú)特的生物學(xué)特性使其被廣泛應(yīng)用于環(huán)境質(zhì)量的生物指示和監(jiān)測［2］.苔蘚植物具有涵養(yǎng)水源、保持水土、循環(huán)與貯存營養(yǎng)物質(zhì)、森林更新、重建與恢復(fù)植被等生態(tài)功能，是生態(tài)系統(tǒng)中必不可少的一類群體［3］.細(xì)葉小羽蘚（Haplocladium microphyllum（Sw.ex Hedw.）Broth.）為羽蘚科（Thuidiaceae）小羽蘚屬（Haplocladium）的一種苔蘚植物，色澤鮮綠，植株纖細(xì)，生長交織錯落有致，不僅具有較高的生態(tài)價值，還具有清熱解毒、消炎等藥用價值.隨著城市化快速發(fā)展，部分地區(qū)干旱化程度不斷加深，而細(xì)葉小羽蘚既可豐富城市園林植物種類，還可維持植物群落的生態(tài)平衡，再現(xiàn)豐富多樣的自然景觀［4-6］.本文作者在野外工作時，觀察發(fā)現(xiàn)我國東南沿海地區(qū)木麻黃林地鮮有苔蘚植物的分布，目前不清楚木麻黃林地化感物質(zhì)對苔蘚植物的生長發(fā)育是否有影響.

木麻黃是我國東南沿海防護(hù)林主要樹種，在東南海岸已有70多年的栽培歷史，其主要作用在于防風(fēng)固沙、改良土壤和改善海岸帶生態(tài)環(huán)境等［7］.但由于木麻黃防護(hù)林樹種單一，群落結(jié)構(gòu)簡單，木麻黃所產(chǎn)生的化感物質(zhì)可以通過自然揮發(fā)、雨霧淋溶、根系分泌、植物殘體分解等途徑聚積在土壤中，這些有毒物質(zhì)不斷積累，不僅抑制自身林下幼苗生長，而且對其他植物產(chǎn)生化感作用［8］.YAO等［9］在木麻黃的凋落物、土壤、根中均檢測出2，4-二叔丁基苯酚（2，4-DTBP）等酚酸類物質(zhì)，且2，4-DTBP的相對含量最高.2，4-DTBP是一種黃白色結(jié)晶固體，不溶于水，至少來源于169種生物［10］，如細(xì)菌［11-12］、真菌［13］、高等植物［14-15］等的天然化合物，具有抗氧活性［16］、抗菌殺蟲活性［17-18］、抗炎活性［19］、植物化感效應(yīng)［20］和除草效應(yīng)［15］等性質(zhì).QIN等［21］研究發(fā)現(xiàn)2，4-DTBP對萵苣（Lactuca sativaL.）、水稻（Oryza sativaL.）以及稗草（Echinochloa crus-galliL.）的種子萌發(fā)和幼苗生長化感抑制活性相對最強(qiáng).ZHANG等［22］在不同植齡啤酒花（Humulus lupulusL.）根系分泌物及根際土壤中檢測出2，4-DTBP的相對含量最高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適宜低濃度的2，4-DTBP對啤酒花生長和光合特性具有促進(jìn)作用，而高濃度的2，4-DTBP能對啤酒花的生長產(chǎn)生化感抑制效應(yīng).XUAN等［23］從茅草（Imperata cylindrica（L.）Beauv.）的根莖和根系分泌物中提取出的2，4-DTBP對雜草萌發(fā)和幼苗生長具有化感抑制作用.GAO等［24］探究內(nèi)蒙古荒漠草原優(yōu)勢植物根分泌物2，4-DTBP對根際微生物的影響時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)2，4-DTBP質(zhì)量濃度高于7.5 g·μL-1時，會對部分細(xì)菌生長有抑制效應(yīng)，土壤細(xì)菌物種多樣性明顯降低.

木麻黃林地中化感物質(zhì)2，4-DTBP相對含量最高，因此，本研究通過施加不同濃度的2，4-DTBP處理細(xì)葉小羽蘚，研究2，4-DTBP對細(xì)葉小羽蘚葉綠素、脯氨酸、丙二醛含量的影響，揭示2，4-DTBP對苔蘚植物的化感作用，為探究細(xì)葉小羽蘚是否適應(yīng)木麻黃林地生態(tài)環(huán)境提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2020年12月11日在康健園、桂林公園、上海師范大學(xué)徐匯校區(qū)、奉賢校區(qū)采集適量細(xì)葉小羽蘚，用蒸餾水洗凈泥土，去除雜質(zhì).以吸水性紗布作為基質(zhì)，將紗布高溫滅菌后，浸沒于蒸餾水中，使紗布吸滿水，然后將紗布平鋪在廣口淺盆中.把已經(jīng)洗凈的細(xì)葉小羽蘚植物體均勻地種植于紗布表面上，放入光照恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，設(shè)定光照12 h/黑暗12 h，溫度22℃，每2 d噴灑蒸餾水50 mL［25］.將其馴化至植物體生長良好狀態(tài)，周期為1周.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

選取馴化后生長一致的植株繼續(xù)培養(yǎng).選擇木麻黃分泌物中的化感物質(zhì)2，4-DTBP，采用化學(xué)分析純（購買自國藥集團(tuán)）作為外源模擬生化試劑.每7 d噴灑一次物質(zhì)的量濃度分別為0（CK），0.01，0.05，0.10，0.50，1.00 mmol·L-1的2，4-DTBP試劑，每次噴灑50 mL，每周測量一次光合色素、脯氨酸和丙二醛的含量，做3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)周期為8周.

1.2.2 測量方法

光合色素的提取測量采用BAO等［26］的方法.比色測定色素，以95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇為空白對照，在665和649 nm波長下測定吸光度，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b含量，參照WANG［27］方法，采用酸性茚三酮法測量脯氨酸含量，采用硫代巴比妥酸（TBA）法測量丙二醛含量.

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用SPSS進(jìn)行顯著性差異分析，并用Origin 2019進(jìn)行制圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 2,4-DTBP對細(xì)葉小羽蘚葉綠素含量的影響

2，4-DTBP對細(xì)葉小羽蘚葉綠素a含量存在“低促高抑”的現(xiàn)象，如圖1所示.

當(dāng)2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度在0～0.05 mmol·L-1時，細(xì)葉小羽蘚的葉綠素a含量明顯高于對照組，差異達(dá)到顯著性水平（P＜0.05），且隨著2，4-DTBP濃度增加，葉綠素a含量逐漸增加.當(dāng)2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度為0.05～0.10 mmol·L-1時，葉綠素a含量出現(xiàn)最高值，比對照組增加9.75%～62.46%.但當(dāng)2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度增加至0.50 mmol·L-1時，葉綠素a含量略低于或約等于對照組.當(dāng)2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度增加至1 mmol·L-1時，葉綠素a含量低于對照組，差異達(dá)到顯著性水平（P＜0.05），比對照組降低0.04%～24.00%.隨著實(shí)驗(yàn)周期的增加，葉綠素a的含量逐漸減少，且低于對照組，除第二周外.2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度為0～0.1 mmol·L-1時，葉綠素a+b含量高于對照組，差異達(dá)到顯著性水平（P＜0.05），且隨著2，4-DTBP濃度增加，葉綠素a+b含量逐漸增加.當(dāng)2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度大于0.50 mmol·L-1時，葉綠素a+b含量相比于對照組無顯著差異，如圖2所示.

圖2 不同濃度2，4-DTBP處理下細(xì)葉小羽蘚中葉綠素a+b含量隨處理時間的變化

由圖1，2可知，適宜物質(zhì)的量濃度（0～0.10 mmol·L-1）的2，4-DTBP能夠使得細(xì)葉小羽蘚的葉綠素含量增加；而2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度大于0.50 mmol·L-1時，細(xì)葉小羽蘚的葉綠素含量下降.

圖1 不同濃度2，4-DTBP處理下細(xì)葉小羽蘚中葉綠素a含量隨處理時間的變化.同一行中的不同的小寫字母表示0.05水平差異顯著性，下同.

2.2 2,4-DTBP對細(xì)葉小羽蘚脯氨酸含量的影響

如圖3所示，當(dāng)2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度在0～0.05 mmol·L-1時，脯氨酸含量低于對照組，差異達(dá)到顯著性水平（P＜0.05），且隨著2，4-DTBP濃度的增大，脯氨酸含量逐漸降低.在2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度為0.05 mmol·L-1時，脯氨酸含量達(dá)到最低值，差異達(dá)到顯著性水平（P＜0.05），比對照組降低0.58%～2.88%；2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度增加至0.50 mmol·L-1時，脯氨酸含量略高于對照組.當(dāng)2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度增加至1.00 mmol·L-1時，脯氨酸含量高于對照組的趨勢更加明顯，差異達(dá)到顯著性水平（P＜0.05），比對照組高2.11%～3.09%.結(jié)果表明，用低濃度2，4-DTBP處理時，細(xì)葉小羽蘚脯氨酸含量降低，而較高濃度的2，4-DTBP使得細(xì)葉小羽蘚脯氨酸含量提高.

圖3 不同濃度2，4-DTBP處理下細(xì)葉小羽蘚中脯氨酸含量隨處理時間的變化

2.3 2,4-DTBP對細(xì)葉小羽蘚丙二醛含量的影響

如圖4所示，當(dāng)2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度在0～0.10 mmol·L-1時，丙二醛含量低于對照組，差異達(dá)到顯 著 性 水 平（P＜0.05），且 隨 著2，4-DTBP濃 度 的 增 大，丙 二 醛 含 量 逐 漸 降 低.當(dāng)2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度為0.10 mmol·L-1時，丙二醛含量出現(xiàn)最低值，差異達(dá)到顯著性水平（P＜0.05），比對照組降低7.20%～23.01%，但當(dāng)2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度大于0.50 mmol·L-1時，丙二醛含量開始逐漸回升.當(dāng)2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度增加至1.00 mmol·L-1時，丙二醛含量趨近于對照組，差值在-4.18%～0.73%波動.結(jié)果表明，用低濃度2，4-DTBP處理時，細(xì)葉小羽蘚丙二醛含量降低，而高濃度2，4-DTBP使得細(xì)葉小羽蘚丙二醛含量提高.

圖4 不同濃度2，4-DTBP處理下細(xì)葉小羽蘚中丙二醛含量隨處理時間的變化

3 結(jié)論與討論

植物光合作用具有制造有機(jī)物，實(shí)現(xiàn)太陽能的轉(zhuǎn)化與儲存，為地球上的生物提供直接或間接的能源，穩(wěn)定大氣中的氧和二氧化碳的含量等重要意義［28］.葉綠素是光合作用必不可少的色素，是吸收光能的物質(zhì)基礎(chǔ)，是光合作用的光敏催化劑，直接影響光合作用的強(qiáng)弱，其含量是植物適應(yīng)環(huán)境生長發(fā)育的重要指標(biāo)［29］.ZHANG等［22］的研究結(jié)果表明，低濃度的2，4-DTBP對啤酒花幼苗光合作用有一定促進(jìn)作用，而高濃度的2，4-DTBP抑制光合作用強(qiáng)度.本研究也得出相似結(jié)論，低物質(zhì)的量濃度（＜0.10 mmol·L-1）的2，4-DTBP能促進(jìn)細(xì)葉小羽蘚葉綠素的合成，高物質(zhì)的量濃度（＞0.50 mmol·L-1）的2，4-DTBP能促使葉綠素降解.

脯氨酸在植物體內(nèi)是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，逆境條件下，植物體內(nèi)脯氨酸含量會有明顯的積累，有利于減輕逆境對植物的傷害，同時在一定程度上反映了植物的抗逆性［30］.LI等［31］研究4種苔蘚植物對不同水族箱水體條件的生理響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)隨著水淹時間的延長，植物葉中脯氨酸積累，調(diào)節(jié)逆境環(huán)境條件下的適應(yīng)能力.本研究得出如下結(jié)論：在2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度低于0.10 mmol·L-1的環(huán)境里，細(xì)葉小羽蘚的脯氨酸含量增加不明顯，當(dāng)2，4-DTBP物質(zhì)的量濃度高于0.50 mmol·L-1時，細(xì)葉小羽蘚的脯氨酸含量增加明顯.細(xì)葉小羽蘚能適應(yīng)低濃度的2，4-DTBP環(huán)境，在高濃度的2，4-DTBP環(huán)境里則產(chǎn)生大量脯氨酸以減輕逆境對其生長的傷害，并反映了高濃度的2，4-DTBP對苔蘚植物的生理活動有一定影響.

活性氧的產(chǎn)生和相關(guān)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是植物感化效應(yīng)的主要作用機(jī)制［32］.2，4-DTBP能通過活性氧的生成誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，引起根系組織和葉片組織中葉綠體的脂質(zhì)過氧化和膜損傷［15］.丙二醛是植物細(xì)胞質(zhì)膜過氧化的最終產(chǎn)物，其含量的多少顯示了植物細(xì)胞質(zhì)膜過氧化的程度，可作為檢測逆境條件下膜系統(tǒng)受損程度的指標(biāo)［33］.HALIM［34］等研究了2，4-DTBP對雜草植物葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)和葉片生理的影響，研究結(jié)果表明，葉綠體的超微結(jié)構(gòu)損傷明顯，類囊體系統(tǒng)紊亂，膜呈波動狀，淀粉粒缺乏，質(zhì)體球蛋白增多，葉片綠度、量子產(chǎn)量和氣孔導(dǎo)度值降低.ZHOU等［35］探究不同濃度2，4-DTBP對番茄葉霉菌及番茄種子萌發(fā)幼苗生長的影響，得出低濃度2，4-DTBP處理能使番茄葉片中丙二醛含量下降，降低膜脂過氧化程度，但處理濃度過大時，將影響植物自我調(diào)節(jié)能力，膜脂過氧化作用增強(qiáng).這與本研究結(jié)果一致，低濃度（＜0.10 mmol·L-1）的2，4-DTBP能夠降低細(xì)葉小羽蘚的丙二醛含量，而高濃度（＞0.50 mmol·L-1）的2，4-DTBP能夠提高細(xì)葉小羽蘚的丙二醛含量.使用低濃度的2，4-DTBP處理苔蘚植物，并未使其體內(nèi)活性氧增多，所以丙二醛含量不高.而高濃度的2，4-DTBP使苔蘚植物體內(nèi)活性氧大量積累，促進(jìn)膜脂過氧化作用增強(qiáng)，使膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，丙二醛含量升高.

綜上所述，低濃度的2，4-DTBP對細(xì)葉小羽蘚生長具有促進(jìn)作用，但高濃度的2，4-DTBP對細(xì)葉小羽蘚生長具有抑制作用.我國東南沿海木麻黃林地的化感物質(zhì)2，4-DTBP大量累積，其濃度已高于適宜細(xì)葉小羽蘚生長發(fā)育的最適濃度，對細(xì)葉小羽蘚生長繁殖有一定抑制效應(yīng).

本研究僅以木麻黃林地化感物質(zhì)中含量最為豐富的2，4-DTBP溶液對細(xì)葉小羽蘚生理反應(yīng)進(jìn)行室內(nèi)實(shí)驗(yàn)，尚未能在木麻黃林地開展野外實(shí)驗(yàn).且實(shí)驗(yàn)只以細(xì)葉小羽蘚為研究對象，苔蘚植物豐富多種，如毛尖紫萼蘚（Grimmia piliferaP.Beauv.）［36］、山墻蘚（Tortula ruralis（Hedw.）G.Gaertn.，B.Mey.&Scherb.）［37］等耐旱苔蘚植物，具有脅迫耐受性，因此，還需對更多種苔蘚植物進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)脅迫實(shí)驗(yàn)研究，為苔蘚植物是否能適應(yīng)木麻黃林地生態(tài)環(huán)境提供參考.