洪靈杰，劉完美，應(yīng)瀚霆，彭可昕，陳程，時(shí)歡，姚雨涵，段文彧

（長沙醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410219）

溶血性鏈球菌由Billrth于1877年發(fā)現(xiàn)，是與人類感染密切相關(guān)的病原菌。因溶血性鏈球菌感染造成的臨床疾病種類繁多，不同感染部位、感染特征的患者，其治療措施均有一定差別。目前，抗生素濫用形勢依然嚴(yán)峻，從食材或中藥材角度挖掘或研發(fā)新型藥物至關(guān)重要[1]。綠原酸（Chlorogenic Acid，CGA）是酚酸化合物中抗菌效果最為顯著的酸類物質(zhì)，廣泛存在于綠咖啡和茶中[2]。金銀花（又稱忍冬）很早就被用于治療各種熱性病，如身熱、熱毒瘡癰、咽喉腫痛以及發(fā)疹等，但是關(guān)于其藥效發(fā)揮的機(jī)制研究直到現(xiàn)代才被發(fā)現(xiàn)和深入研究[3-4]。已有研究證實(shí)，金銀花中富含CGA，高純度CGA能有效治療流感病毒、病毒性心肌炎、呼吸道感染和皰疹病毒。此外，CGA還是一種常見的生物活性膳食多酚，其主要功效為抗氧化、抗炎癥、解熱以及保護(hù)神經(jīng)，而最新研究顯示其還具有一定的抗菌功效[5]。本文對80只健康成年小鼠進(jìn)行了對照實(shí)驗(yàn)研究，旨在探究金銀花提取物綠原酸干預(yù)鏈球菌感染模型小鼠對血清炎癥指標(biāo)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

由長沙醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供（清潔級）健康成年小鼠80只，雌性小鼠40只，雄性小鼠40只，體重在160～180 g。實(shí)驗(yàn)室模擬光照和黑暗場景各12 h交替進(jìn)行飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室室溫控制為22～25 ℃，濕度控制為43%～55%。

1.2 儀器與試劑

BS-2000M型全自動生化分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；TSA8000型全自動凝血分析儀，美德太平洋（天津）生物科技股份有限公司。

乙醇，試劑純，東莞市勛業(yè)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸，試劑純，上海純優(yōu)生物科技有限公司；乙酸乙酯，試劑純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司；聚酰胺；分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇，試劑純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生理鹽水，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將小鼠分為模型組和CGA組，每組各40只，保持兩組小鼠的生活環(huán)境和飲食等條件完全相同一周后，將乙型溶血性鏈球菌用注射器分別注入模型組和CGA組的小鼠體內(nèi)。溶血性鏈球菌感染潛伏期在3個(gè)月左右，其主要癥狀為咽痛、寒顫、發(fā)熱、惡心嘔吐、咽部腫大、扁桃體腫大以及頸部淋巴結(jié)腫大。當(dāng)兩組小鼠出現(xiàn)發(fā)熱、寒顫、惡心、嘔吐以及動作頻繁等癥狀時(shí)，用注射器吸取適量生理鹽水，注入模型組小鼠體內(nèi)；用注射器吸取適量CGA水溶液（劑量5 mg/kg）注入CGA組小鼠體內(nèi)。

CGA提取方法：（1）稱取金銀花50 g加入到1 000 mL的圓底燒瓶中，并加入500 mL（10倍量）70%的乙醇，于75 ℃冷凝回流3 h，倒出液體，再用400 mL（8倍量）、400 mL（8倍量）回流2次，每次2 h，過濾，合并濾液，然后在80 ℃條件下濃縮濾液或者用旋蒸儀旋干濾液至無醇味。（2）分離純化。以濃度為6 mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH值至3.0左右，以3倍量的乙酸乙酯分3次萃取，合并萃取液（乙酸乙酯層），以5%的氫氧化鈉溶液調(diào)萃取液pH至8.0左右，分取水層減壓濃縮。用聚酰胺拌樣，用聚酰胺（80～100目）裝柱（用量大概為綠原酸粗品的5倍），裝入柱徑與柱長比為1∶7的層析柱中，常壓下用10%的乙醇作為洗脫劑洗脫，收集流分，點(diǎn)樣與標(biāo)準(zhǔn)品對照（標(biāo)準(zhǔn)品用50%的甲醇溶解，0.2 mg/mL），合并相同流分，旋干即為所要提取的綠原酸。使用時(shí)，將提取的綠原酸稀釋到5 mg/kg濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 指標(biāo)測定

用全自動生化檢測儀定量檢測C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）含量。用全自動凝血分析儀測定白細(xì)胞計(jì)數(shù)（White blood cell count，WBC）、凝血酶原時(shí)間（PT）、凝血酶時(shí)間（TT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、纖維蛋白原（FIB）水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析。兩組計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩組小鼠凝血功能相關(guān)指標(biāo)的比較

由表1可知，CGA組FIB含量低于模型組，PT、APTT、TT高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明金銀花提取物CGA干預(yù)后的模型組其凝血功能各項(xiàng)指標(biāo)均有積極好轉(zhuǎn)，這是因?yàn)镃GA可在一定程度清除和抑制溶血性鏈球菌的生長和繁殖，從而緩解血小板的異?；罨?，最終改善小鼠凝血功能，同時(shí)其對小鼠凝血功能的影響可能還與其有效緩解內(nèi)皮細(xì)胞損傷，最終積極改善血小板聚集有關(guān)。

表1 兩組小鼠凝血功能相關(guān)指標(biāo)的比較（±s）

表1 兩組小鼠凝血功能相關(guān)指標(biāo)的比較（±s）

組別 PT/s FIB/（g/L） APTT/s TT/s模型組（n=40）9.51±1.29 4.51±0.84 22.17±4.02 15.04±1.96 CGA組（n=40）12.04±1.63 2.60±0.32 28.69±4.71 17.82±2.34 t 7.697 13.438 6.659 5.760 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 兩組小鼠血清炎癥相關(guān)指標(biāo)的比較

由表2可知，CGA組小鼠CRP含量高于模型組，IL-6、TNF-α、IL-1β、WBC含量低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL-6是由T淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌產(chǎn)生的一種促炎細(xì)胞因子，在炎癥初期IL-6會在病變位置大量合成并且由血液進(jìn)入肝臟，誘導(dǎo)機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)大量合成CRP、SAA等相關(guān)蛋白[6]。具體分析CGA組小鼠IL-6的變化特征，主要與CGA作為AMPK/Nrf2通路的激活劑，通過抑制NF-κB、JAK-1、STAT-1和MAPK通路的磷酸化，從而對脂多糖誘導(dǎo)作用進(jìn)行抑制，達(dá)到抑制急性和慢性炎癥反應(yīng)作用有關(guān)。此次研究中發(fā)現(xiàn)溶血性鏈球菌感染會導(dǎo)致小鼠血清中IL-6明顯升高，CGA干預(yù)后IL-6的表達(dá)降低，CGA降低IL-6表達(dá)效果好，說明CGA具有較強(qiáng)的抗炎作用。同時(shí)，鏈球菌感染小鼠模型制作過程中，溶血性鏈球菌感染會導(dǎo)致體內(nèi)促炎因子如IL-6和TNF-α和iNOS大量增加，互相促進(jìn)導(dǎo)致炎癥因子的進(jìn)一步增加，從而損害體內(nèi)各個(gè)器官。尤其是TNF-α作為免疫系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子，通過其TNFR1激活和召集免疫細(xì)胞，在炎癥的傳播中發(fā)揮重要作用。而CGA主要作用于機(jī)體免疫系統(tǒng)，能有效增強(qiáng)免疫系統(tǒng)能力，對上皮淋巴細(xì)胞和腸道固有層淋巴細(xì)胞中INF-γ和TNF-α水平有一定影響。因此，CGA對鏈球菌感染小鼠發(fā)揮抗炎影響的機(jī)制不局限于信號通路，還可影響人體免疫功能的漸變或強(qiáng)化，最終發(fā)揮干預(yù)效果。

表2 兩組小鼠血清炎癥相關(guān)指標(biāo)的比較（±s）

表2 兩組小鼠血清炎癥相關(guān)指標(biāo)的比較（±s）

組別 CRP/（μm/mL） IL-6/（ng/L） TNF-α/（ng/L） IL-1β/（pg/mL） WBC/（×109/L）模型組（n=40） 45.63±2.51 75.54±5.01 68.16±4.27 75.26±6.33 14.75±2.17 CGA 組（n=40） 51.86±2.76 60.14±4.55 51.32±3.19 55.24±4.17 12.36±1.63 t 10.561 14.391 19.982 16.704 5.569 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 討論

基于其藥理和生理層面的優(yōu)異表現(xiàn)，可嘗試將該藥材作為藥食同源食材進(jìn)行推廣應(yīng)用。但是該研究亦有一定不足之處，僅進(jìn)行了空白組和實(shí)驗(yàn)組的設(shè)計(jì)，缺乏條件對照組，因此僅能驗(yàn)證CGA對鏈球菌感染的干預(yù)效果，但無法同其他抗炎或抗菌藥物的效果進(jìn)行組間比較。

3 結(jié)論

本研究通過溶血性鏈球菌感染的小鼠模型，探究了金銀花提取物綠原酸對小鼠凝血功能和炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，綠原酸可有效改善溶血性鏈球菌感染小鼠的凝血功能和炎癥反應(yīng)。