李博宇，王啟文，劉英芹

（桂林醫(yī)學(xué)院 智能醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣西桂林 541199）

通常動(dòng)物骨組織制片中，會(huì)將皮膚、多余的肌肉和結(jié)締組織剔除，使骨組織充分暴露在脫鈣液中。但在小鼠足趾再生實(shí)驗(yàn)中需要完整保留軟組織，需要精確控制脫鈣液的濃度和脫鈣時(shí)間。如果脫鈣方法不恰當(dāng)，則可能會(huì)損傷軟組織。因此選擇合適的方法非常重要[1-2]。

骨組織中含有大量脂肪，填充于骨髓腔和其他管腔的孔隙中，脂肪的疏水性導(dǎo)致部分化學(xué)試劑難以進(jìn)入骨基質(zhì)孔隙中[3]。同種異體骨移植實(shí)驗(yàn)表明，脂肪去除程度越高的骨移植材料在植入體內(nèi)后更容易被體液浸潤(rùn)[4]。脫鈣效率受溶液濃度、溫度、暴露時(shí)間和滲透率的影響[5],對(duì)組織進(jìn)行脫脂，去除組織內(nèi)的脂肪，能使脫鈣液更易滲入，從而提高脫鈣效率。本文中的小鼠趾骨體積小且被皮膚等軟組織包被（末端的第三趾骨被趾甲包裹），軟組織中還存在大量脂質(zhì)，多重防護(hù)下，脫鈣液難以直接接觸骨組織。通過(guò)鼠趾脫脂處理，希望能夠加快脫鈣效率，減少組織在酸中浸潤(rùn)時(shí)間，保證染色質(zhì)量，為小體積且需要保留軟組織的骨組織脫鈣提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

蘇木素染液（Harris），珠海貝索生物技術(shù)有限公司；伊紅染液（水溶性），珠海貝索生物技術(shù)有限公司；甲酸、濃鹽酸、二甲苯，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；磷酸緩沖鹽粉劑（CC0002），北京雷根生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；多聚甲醛（C104188），分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯甲烷，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；中性樹(shù)膠100 mL（G8590），北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YD-6L生物組織冷動(dòng)臺(tái)，金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；YD-6L生物組織包埋機(jī)，金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；YD-335A型電腦切片機(jī)，金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；YD-AB2生物組織攤烤片機(jī)，金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；TKD-TSF生物組織智能脫水機(jī)，湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司；ECLIPSE 80i高級(jí)研究型熒光正立顯微鏡，日本Nikon公司。

1.3 溶液配制

20%脫鈣液：10 mL甲酸，10 mL鹽酸，80 mL磷酸鹽緩沖鹽溶液。

4%甲醛溶液：將40 g多聚甲醛溶解到960 mL蒸餾水中。

磷酸鹽緩沖鹽溶液：將1袋（重約10 g）的磷酸緩沖鹽粉劑溶于1 000 mL蒸餾水。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇6～8周健康雄性昆明小鼠10只，體重為30～35 g，購(gòu)自桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.5 組織制片處理

戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠后，均從左右后肢取中間第三鼠趾。樣品在4%甲醛溶液中浸泡12 h，脫脂組：三氯甲烷脫脂4 h，水洗后脫鈣；對(duì)照組：直接脫鈣。所有組織采用同一種脫鈣液，且每隔12 h更換脫鈣液。脫脂時(shí)間計(jì)入脫鈣時(shí)間（如脫鈣24 h是指脫脂4 h，水洗，然后脫鈣20 h）。脫鈣完成后立即用流水沖洗12 h，再放入脫水機(jī)中脫水和浸蠟處理，石蠟包埋，切片厚度為4 μm，常規(guī)HE染色，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.6 評(píng)價(jià)方法

參照表1，在切片階段觀察組織，記錄得分；HE染色后鏡下觀察組織，記錄得分。

表1 鼠趾石蠟切片、HE染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS Statistics 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件處理，t檢驗(yàn)分別比較各脫鈣時(shí)間3個(gè)單項(xiàng)得分（切面完整性、組織平整度、核質(zhì)對(duì)比）和總分（3項(xiàng)得分之和）共4組數(shù)據(jù)，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)間脫鈣效果

由圖1可知，脫脂組整體得分高于對(duì)照組，其中脫脂組得分最高點(diǎn)位于24 h，得分為（13.57±1.44）分，最低點(diǎn)位于72 h，得分為（12.63±2.96）分；對(duì)照組得分最高點(diǎn)位于36 h，得分為（13.27±1.56）分，最低點(diǎn)位于12 h，得分為（11.00±2.17）分。比較兩組各時(shí)間段總分，發(fā)現(xiàn)脫鈣12 h和24 h有顯著性差異（P＜0.05）。表明脫脂對(duì)短時(shí)間內(nèi)的脫鈣作用最為明顯，兩組間差異隨著脫鈣時(shí)間的增加呈現(xiàn)出減少的趨勢(shì)。

圖1 對(duì)照組與脫脂組在不同脫鈣時(shí)間下的得分

2.2 對(duì)切片質(zhì)量的影響

由圖2可知，在切片完整性方面，脫脂組各時(shí)間段均可切出完整切片，同組間無(wú)顯著差異，脫鈣12 h切片質(zhì)量明顯優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01）。對(duì)照組脫鈣12 h切片過(guò)程中有砂礫感，特別是第三趾骨被趾甲包裹處，切片時(shí)肉眼可見(jiàn)有砂粒狀白色粉末，甚至?xí)l(fā)生趾甲脫落，伴有第三趾骨部分組織缺損，蠟帶也可觀察到組織脫落形成的空洞，24 h之后連續(xù)切片完整性要明顯優(yōu)于12 h（P＜0.05）。隨脫鈣時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)照組切片質(zhì)量逐漸上升，兩組間差異逐漸減小，脫鈣24 h后與脫脂組無(wú)明顯差異。

圖2 對(duì)照組與脫脂組在脫鈣12 h和72 h單項(xiàng)得分

在組織平整度方面，脫鈣12 h對(duì)照組、脫脂組在關(guān)節(jié)處均出現(xiàn)虛影（見(jiàn)圖4中A’和B’），組織未處于同一平面，平整度欠佳，對(duì)照組36 h后有明顯改善（P＜0.05），脫脂組在脫鈣24 h即可獲得平整度較高的切片（P＜0.05）。通過(guò)脫脂加速脫鈣，短時(shí)間內(nèi)即可獲得質(zhì)量較高的切片。在脫鈣12～72 h時(shí)，脫鈣時(shí)間越長(zhǎng)，平整度越好，脫鈣12 h與72 h平整度有顯著差異（P＜0.001）。

2.3 對(duì)HE染色效果的影響

2.3.1 脫鈣12 h、72 h蘇木素染色結(jié)果對(duì)比

組織脫鈣過(guò)度或脫鈣不足都會(huì)直接影響制片的質(zhì)量和染色效果[6]。脫鈣時(shí)間過(guò)短或脫鈣不充分，則難以得到完整切片。脫鈣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)損傷蛋白和核酸，無(wú)法著染蘇木素和其他堿性材料[7-8]，核質(zhì)對(duì)比度不佳，細(xì)胞結(jié)構(gòu)分辨不清。如圖3所示，對(duì)照組和脫脂組在脫鈣處理12 h后，蘇木素著色效果較好，色澤鮮艷，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，其中脫脂組著色略深于對(duì)照組。兩組在脫鈣處理72 h時(shí)，蘇木素著色效果變差，細(xì)胞核染色較淡。

圖3 脫鈣12 h和72 h蘇木素染色效果比較

2.3.2 脫鈣12 h、72 h HE染色結(jié)果對(duì)比

脫鈣12 h，40倍鏡下對(duì)照組染色均勻，第三趾骨結(jié)構(gòu)有缺損，趾甲脫落（見(jiàn)圖4A），HE染色較好，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)；200倍鏡細(xì)胞核著色較好，核質(zhì)對(duì)比清晰，但在關(guān)節(jié)處切面不平，出現(xiàn)虛影（見(jiàn)圖4A’）。脫脂組鼠趾邊緣著色過(guò)深（見(jiàn)圖4B），藍(lán)紫色細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，關(guān)節(jié)處結(jié)構(gòu)完整；200倍鏡細(xì)胞核整齊排列清晰可見(jiàn)，胞質(zhì)對(duì)比明顯，在關(guān)節(jié)處出現(xiàn)與對(duì)照組相同的虛影（圖4B’）。虛影出現(xiàn)的原因可能是脫鈣不完全，使骨組織褶皺。

圖4 脫鈣12 h HE染色效果比較

脫鈣72 h，對(duì)照組染色過(guò)淺，40倍鏡下已無(wú)法觀察到細(xì)胞核（見(jiàn)圖5A），200倍鏡下可看到淡藍(lán)色細(xì)胞核，對(duì)比度差（見(jiàn)圖5A’)。脫脂組染色偏淡，40倍鏡下著色較淺（見(jiàn)圖5B），200倍鏡下可見(jiàn)淡藍(lán)色細(xì)胞核，核質(zhì)對(duì)比質(zhì)量略好于對(duì)照組（見(jiàn)圖5B’)。相比于脫鈣12 h，脫鈣72 h時(shí)染色質(zhì)量下降，對(duì)比度降低。

圖5 脫鈣72 h HE染色效果比較

3 結(jié)論

脫鈣前脫脂處理可以提高鼠趾脫鈣效率，對(duì)染色有促進(jìn)作用。脫鈣12 h后切片，由于脫鈣時(shí)間過(guò)短，導(dǎo)致脫鈣不完全，關(guān)節(jié)處未處在同一平面，因此脫脂處理的組織，脫鈣時(shí)間也應(yīng)不低于24 h。兼顧切片和染色質(zhì)量的綜合考量下，對(duì)照組最佳脫鈣時(shí)間為36～48 h，脫脂組在24～48 h均可保證切片和染色質(zhì)量。無(wú)論是否脫脂處理，脫鈣時(shí)間建議不要超過(guò)48 h。