高 丹 吳 影 李麗娟 李化敏 付雪蓮 郭素芬 展 濤

牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院病理診斷中心，黑龍江牡丹江 157000

甲 狀 腺 癌（thyroid cancer，TC）發(fā) 病 率 約8.7/100 000[1]，乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid cancer，PTC）占TC的64.21%，是最常見的甲狀腺惡性腫瘤類型[2]。近年來，甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)病率日益增多，多數(shù)甲狀腺結(jié)節(jié)是“非典型性增生”病變，如果發(fā)生迅速增長(zhǎng)的甲狀腺結(jié)節(jié)，應(yīng)懷疑甲狀腺惡性腫瘤，但是高效預(yù)測(cè)TC的檢測(cè)手段還需要深入探索。Sur等在分子層面檢測(cè)甲狀腺結(jié)節(jié)組織的炎癥基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTC常伴有不同程度的甲狀腺炎表現(xiàn)。40%PTC病理標(biāo)本表現(xiàn)出橋本甲狀腺炎（hashimoto’s thyroiditis，HT）特征[4]。這不僅證明PTC和HT的病理演變關(guān)系，還揭示HT與PTC均有大量T細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，這反映了免疫系統(tǒng)在HT與PTC區(qū)域產(chǎn)生相似作用[5]，雖然進(jìn)一步解釋了HT與PTC的密切關(guān)聯(lián)性，但是這兩種疾病的發(fā)生、演變的基因表達(dá)差異還要深入研究。揭示HT與PTC共同基因，篩查兩種疾病的核心蛋白及潛在分子機(jī)制，將對(duì)判斷HT發(fā)展和確診PTC具有重要臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

DisGenet數(shù)據(jù)庫（www.disgenet.org），生物信息學(xué)與進(jìn)化基因組學(xué)平臺(tái)（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn），UniProt數(shù) 據(jù) 庫（www.uniprot.org），Metascape數(shù)據(jù)庫（metascape.org），String 11.0數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）。

1.2 方法

1.2.1 HT和PTC基因表達(dá)譜 DisGenet數(shù)據(jù)庫獲得C0677607和C0238463數(shù)據(jù)集，分別為HT和PTC基因表達(dá)譜[6]。生物信息學(xué)與進(jìn)化基因組學(xué)平臺(tái)篩選HT和PTC基因表達(dá)譜的共同基因。UniProt數(shù)據(jù)庫對(duì)共同基因名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2.2 蛋白質(zhì)相互作用和核心蛋白的篩選 String 11.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)共同基因編碼蛋白質(zhì)的相互作用[7]。Cytoscape3.8的CytoHubba 0.1插件，以Degree值中位數(shù)為準(zhǔn)篩選核心基因編碼的蛋白質(zhì)。

1.2.3 生物學(xué)過程和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 通路富集分析 Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)核心蛋白生物學(xué)過程和KEGG信號(hào)通路進(jìn)行富集分析[8]。

2 結(jié)果

2.1 HT與PTC的共同基因

DisGenet數(shù)據(jù)庫獲得HT和PTC差異性基因分別為335個(gè)和1348個(gè)，147個(gè)共同基因，見圖1。

圖1 橋本氏甲狀腺炎與乳頭狀甲狀腺癌差異性基因的Venny圖

2.2 蛋白質(zhì)相互作用與核心蛋白

String 11.0數(shù)據(jù)庫對(duì)147個(gè)共同基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，共有137個(gè)節(jié)點(diǎn)，2024條連線，見圖2A。Degree值中位數(shù)為24.5，大 于24.5的核 心蛋 白 質(zhì) 包 括IL-6、TP53、INS、VEGFA、TNF，見圖2B。

圖2 橋本氏甲狀腺炎與乳頭狀甲狀腺癌的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)與核心蛋白的篩選

2.3 細(xì)胞增殖和血管發(fā)生的生物學(xué)過程富集分析

5個(gè)核心蛋白的細(xì)胞增殖生物過程包括46條，見圖3A。Degree值中位數(shù)為4，大于4的細(xì)胞增殖過程依次是細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖等21條，見表1，圖3A。IL6、TNF核心蛋白與細(xì)胞增殖生物過程緊密相關(guān)，見圖3A。

INS未參與血管發(fā)生過程，4個(gè)核心蛋白的血管發(fā)生生物過程包括22條，圖3B。血管發(fā)生過程的Degree值中位數(shù)為3，大于3的血管發(fā)生過程依次是組織重塑、血管生成、血管發(fā)育等8條，見表1，圖3B。TNF、VEGFA、IL6與血管發(fā)生過程相關(guān)，圖3B。以上結(jié)果提示TNF、IL6與甲狀腺乳頭狀癌增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但是分子機(jī)制還需要深入研究。

表1 橋本氏甲狀腺炎與乳頭狀甲狀腺癌核心蛋白的細(xì)胞增殖和血管發(fā)生過程富集分析

注 A.5個(gè)核心蛋白質(zhì)與細(xì)胞增殖過程的熱圖。聚類分析采用Pearson相關(guān)距離度量和平均鏈接聚類算法。橫軸為核心蛋白質(zhì)，縱軸表示細(xì)胞增殖過程的基因本體論術(shù)語。B. 4個(gè)核心蛋白質(zhì)與血管發(fā)生過程的熱圖。聚類分析采用Pearson相關(guān)距離度量和平均鏈接聚類算法。x軸為核心蛋白質(zhì)，y軸表示血管發(fā)生過程的基因本體論術(shù)語。

2.4 信號(hào)通路富集分析

5個(gè)核心蛋白質(zhì)的KEGG信號(hào)通路包括15條信號(hào)通路，圖4。KEGG信號(hào)通路富集分析的Degree值中位數(shù)為1，大于1的KEGG信號(hào)通路依次是MAPK、人T細(xì)胞白血病病毒1感染、Ras等7個(gè)通路，表2，見圖4。發(fā)揮主要KEGG分子信號(hào)通路作用的核心蛋白質(zhì)包括TP53、IL-6、VEGFA，見圖4。結(jié)果說明KEGG信號(hào)通路的核心蛋白與前述細(xì)胞增殖或血管發(fā)生的基因相一致。

表2 橋本氏甲狀腺炎與乳頭狀甲狀腺癌核心蛋白質(zhì)的KEGG信號(hào)通路富集分析

圖4 橋本氏甲狀腺炎與乳頭狀甲狀腺癌的KEGG信號(hào)通路富集分析熱圖

聚類分析采用Pearson相關(guān)距離度量和平均鏈接聚類算法。橫軸為核心蛋白質(zhì)，縱軸表示KEGG信號(hào)通路的基因本體論術(shù)語。

3 討論

TC逐年高發(fā)，但是致病原因尚不明確。PTC是TC的重要類型，提前判斷PTC的發(fā)生或發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)遏制甲狀腺惡性腫瘤的發(fā)展具有積極作用。自從1955年首次提出HT以來，HT與TC的關(guān)系仍然是研究和爭(zhēng)議的焦點(diǎn)[3]。倫語等[9]在切除甲狀腺腫瘤組織中常發(fā)現(xiàn)HT的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。最近對(duì)HT進(jìn)行甲狀腺切除術(shù)的患者進(jìn)行免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)及臨床回顧性分析表明，HT患者續(xù)發(fā)PTC的患病率顯著增加[4-5]。雖然各方研究結(jié)果存在一定差異，但是已經(jīng)提示HT的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)通常與PTC相關(guān)，HT可能是發(fā)展為PTC的危險(xiǎn)因素。

為判斷HT和PTC關(guān)聯(lián)性，本試驗(yàn)采用生物信息學(xué)技術(shù)，分別檢測(cè)HT和PTC的致病基因。然后利用Venny技術(shù)，篩選兩種疾病交集基因?yàn)閮煞N疾病的共同基因，即獲得HT和PTC的共同表達(dá)基因。這些共同基因可能是HT繼發(fā)PTC的關(guān)鍵因素。本研究只采取DisGenet數(shù)據(jù)庫查找兩種疾病差異基因，還存在數(shù)據(jù)量實(shí)時(shí)更新的問題，后期會(huì)持續(xù)關(guān)注數(shù)據(jù)庫資料變化及新的差異基因。

經(jīng)過篩查獲得HT與PTC共同基因有147個(gè)，排名在Degree值中位數(shù)前5位的核心蛋白包括IL-6、TP53、INS、VEGFA、TNF。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6為單核細(xì)胞培養(yǎng)必不可少的輔助因子，作為輔助信號(hào)激活T細(xì)胞，促進(jìn)Th17細(xì)胞活化，對(duì)實(shí)體瘤發(fā)揮持久免疫力[10]。TNF-α能夠促進(jìn)膽管癌和肝細(xì)胞癌患者中的外周血單核細(xì)胞亞群的頻率升高[11]。VEGFA是重要的促進(jìn)血管生成因子，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有很好的促進(jìn)作用。TP53是重要的抑癌基因，肝癌患者TP53突變的腫瘤具CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)明顯下降，導(dǎo)致腫瘤免疫微環(huán)境發(fā)揮抑制，TP53突變的肝癌患者，其生存時(shí)間顯著縮短[12]。雖然關(guān)于IL-6、TP53、VEGFA、TNF與T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或單核細(xì)胞增生相關(guān)的研究較多，但是INS與細(xì)胞增殖的關(guān)系研究卻少見報(bào)道。

甲狀腺結(jié)節(jié)有無血液供應(yīng)對(duì)診斷結(jié)節(jié)良惡性非常重要，本研究預(yù)測(cè)了核心基因與PTC血管新生的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-6及其受體是腎上腺皮質(zhì)腫瘤組織等腫瘤新血管新生、腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子[13]。TP53基因具有非常重要調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，凋亡和新血管形成功能，50%以上的癌癥患者發(fā)生該基因突變。TP53基因突變可明顯促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，從而顯著增加患癌的風(fēng)險(xiǎn)[14]。因此，TP53基因編碼的p53蛋白已經(jīng)成為抗腫瘤或抗腫瘤血管生長(zhǎng)藥物的重要靶標(biāo)[14]。INS與血管新生關(guān)系未見報(bào)道，是今后需要關(guān)注的研究方向。

IL-6、TP53、VEGFA、TNF核心基因KEGG信號(hào)通路包括甲狀腺激素信號(hào)通路、TC、基底細(xì)胞癌等信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，良性甲狀腺疾病和PTC患者血清IL-6水平明顯升高，與良性甲狀腺疾病患者相比，PTC患者的甲狀腺激素水平明顯更高，這與血清IL-6水平增高預(yù)示PTC患者的總生存率顯著降低的研究相符[15]。研究認(rèn)為，與健康個(gè)體相比，甲狀腺良性疾病和PTC患者的血清TNF-α，L-Selectin和VCAM-1顯著增高，相對(duì)于甲狀腺良性疾病，PTC原發(fā)腫瘤中TNF-α和L-Selectin的表達(dá)也明顯更高。L-Selectin和VCAM-1的表達(dá)與腫瘤侵襲性行為相關(guān)，PTC患者血清TNF-α與L-Selectin水 平 正 相 關(guān)，提示TNF-α水平增高預(yù)示著PTC轉(zhuǎn)移行為可能高度發(fā)生，因此血清TNF-α是乳頭狀甲狀腺癌患者重要預(yù)后指標(biāo)[16]。Heidari 等研究發(fā)現(xiàn)TP53在PTC患者明顯降低，失去抑癌基因TP53調(diào)控的甲狀腺組織獲得乳頭狀甲狀腺癌易感性而演變?yōu)榧谞钕侔17]。Wagner K研究PTC轉(zhuǎn)移因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC高度表達(dá)VEGFA[18]。

雖然本研究預(yù)測(cè)的HT和PTC關(guān)聯(lián)性以及核心蛋白質(zhì)的篩選，是基于在線數(shù)據(jù)庫的預(yù)測(cè)結(jié)果，但是已經(jīng)得到了關(guān)于兩種疾病的密切關(guān)系和潛在分子機(jī)制的證據(jù)。本研究認(rèn)為聯(lián)合檢測(cè)IL-6、TP53能夠有助于判斷HT演變和早期診斷PTC，若增加檢測(cè)TNF-α和VEGFA，將有利于判斷PTC是否發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而指導(dǎo)臨床診斷或治療。