陸昌彬

復旦大學附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院心內科，福建廈門 361015

參松養(yǎng)心膠囊由人參、麥冬、山茱萸、丹參、酸棗仁（炒）、桑寄生、赤芍、甘松、黃連、南五味子、龍骨、土鱉蟲組成，具有益氣養(yǎng)陰，活血通絡，清心安神的功效，可用于治療室性早搏，氣陰兩虛，心絡瘀阻等臨床證型[1]。1990—2013年，在人口老齡化的趨勢下，中國患心血管疾病的病死人口數增加了46%[2-4]。研究表明，參松養(yǎng)心膠囊對于冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q“冠心病”）的治療具有較好的效果[5]，但具體的藥理分子機制尚未完全闡明。本研究應用網絡藥理學的方法，挖掘參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的作用靶點，探究其治療冠心病的可能作用機制，為今后冠心病的相關研究提供思路和依據。

1 材料和方法

1.1 參松養(yǎng)心膠囊化學成分及靶點獲取

通過檢索中藥數據庫TCMSP（http: //lsp.wsuaf.edu.cn/tcmsp）以 及BATMAN-TCM（http: //bionet.ncpsb.org/batman-tcm），設定口服吸收率（oral absorption，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選條件，對所有的成分進行檢索。使用Uniprot數據庫將檢索得到的成分轉為相應的靶點。

1.2 冠心病靶點獲取

利 用Drugbank數 據 庫（https: //go.drugbank.com/）進行關鍵詞“coronary heart disease”檢索，并通過Uniprot數據庫獲取疾病相關靶點。

1.3 藥物與疾病共同靶點獲取

應用Venny 2.1.0 （bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對藥物和疾病的靶點進行交集，篩選出二者的共同靶點。

1.4 構建“藥物-活性成分-共同靶點”網絡圖

利用Cytoscape 3.7.1軟件建立藥物-活性成分-共同靶點-疾病的網絡圖，每個節(jié)點（node）代表基因、蛋白或活性成分，節(jié)點與節(jié)點之間的連接（edge）代表活性成分與其作用靶點之間的聯系。

1.5 靶蛋白相互作用網絡的構建與分析

將藥物與疾病共有靶點導入String數據庫，構建參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的靶蛋白互作網絡。限定物種為人類（homo sapiens），設定最低相互作用閾值為中等置信（medium confidence）0.4，其余參數保持不變，得到蛋白相互作用關系，保持為TSV格式。將該TSV格式文件導入Cytoscape 3.7.1軟件，進行靶點間網絡分析，并進行可視化處理。

1.6 GO功能分析及KEGG信號通路富集分析

將參松養(yǎng)心治療冠心病的潛在靶點導入DAVID數據庫進行基因富集分析。設定Count值＞6，同時以P值＜0.01作為篩選條件，對共同靶點進行GO分析以及KEGG分析。

2 結果

2.1 參松養(yǎng)心膠囊及冠心病主要靶點篩選結果

通過檢索參松養(yǎng)心化學成分，去除重復值后，共有185個化學成分。將所有篩選的化學成分導入Uniprot數據庫，去除重復值后，最終得到531個藥物作用靶點。通過Drugbank數據庫進行冠心病疾病靶點檢索，共檢索到216個。利用Venny 2.1.0繪制韋恩圖，同時得到共有靶點44個（圖1）。

圖1 參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的藥物-疾病共同靶點韋恩圖

2.2 PPI網絡與核心靶點分析

應用String數據庫及Cytoscape 3.7.1繪制靶蛋白-蛋白互作網絡（protein-protein interaction，PPI）網絡圖（圖2）。篩選出介數和度值大于中位數的靶點作為核心靶點，共得到6個核心靶點，分別為SCN5A、IGHG1、NOS3、PDE3A、HTR2A、KCNH2。土鱉蟲、五味子兩味中藥與冠心病無交集靶點，在藥物-活性成分-共同靶點網絡中剔除，其中丹參是對應活性成分最多的中藥（圖3）。

圖2 參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的PPI網絡圖

圖3 參松養(yǎng)心膠囊與冠心病藥物-活性成分-共同靶點網絡圖

2.3 核心靶點生物功能富集分析

應用DAVID數據庫進行GO功能富集分析，共篩選出22個條目，其中生物過程（biological process，BP）條目6個，細胞組成（cellular component，CC）條目11個，分子功能（molecular function，MF）相關條目5個（圖4）。

圖4 參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的潛在作用靶點的GO分析

GO富集分析表明，生物過程主要包括鉀離子跨膜轉運、離子跨膜轉運的調控等過程。細胞成分主要包括細胞膜、神經樹突、電壓門控鉀通道復合體。分子功能主要包括延遲整流鉀通道活性、電壓門控鉀通道活性等。

利用DAVID數據庫進行KEGG信號通路分析，結果顯示，主要富集到靶點數量居前3位的信號通路包括5-羥色胺能突觸、鈣離子信號通路、縫隙連接（圖5）。

圖5 參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的潛在作用靶點的KEGG信號通路富集

2.4 藥物作用機制分析

藥物活性成分-核心靶點-信號通路網絡相互作用分析表明，參松養(yǎng)心膠囊中包含的12種活性成分作用主要作用于5-羥色胺能突觸、鈣離子信號通路。從KEGG信號通路分析結果可得知5-羥色胺能突觸涉及9個作用基因，鈣離子信號通路涉及8個作用基因。根據藥物活性成分-核心靶點-信號通路網絡圖的Degree值，其中靶標HTR2A、NOS3與此作用過程關系最為密切，可能是參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的關鍵靶點（圖6）。

圖6 參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的“藥物活性成分-核心靶點-信號通路”網絡圖

3 討論

本研究采用網絡藥理學對參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的作用機制進行探究。結果表明，參松養(yǎng)心膠囊共含有12味中藥，有效活性成分共185個，對應的相關靶點共531個，其中冠心病相關靶點216個。冠心病與參松養(yǎng)心膠囊共有基因44個，通過藥物-活性成分-共同靶點網絡圖進行分析，發(fā)現丹參在參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的作用尤為突出。

心血管疾病包括冠心病、風濕性心臟病、周圍血管疾病、心力衰竭、先天性心臟病和心肌病等[6]。丹參被廣泛用于心血管疾病，例如動脈粥樣硬化、心絞痛等[7]，研究表明，丹參可以明顯改善胸痛、胸悶、心悸、呼吸急促等臨床癥狀，使冠心病患者心電圖逐漸趨于正常[7]。丹參的主要化學成分超過200種，可分為水溶性（親水性）酚類化合物和非極性（脂溶性）二萜類化合物兩大類。丹酚酸和二萜丹參酮是本植物中兩種具有代表性的親水性和親脂性成分[8]。丹參的心血管保護作用有多種機制，包括抗炎、抗氧化、抗血栓、抗血管平滑肌細胞增殖，抑制血管內皮細胞和白細胞中黏附分子的表達，急性心肌缺血的改善等[9]。

本研究結果顯示，HTR2A、NOS3是參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病過程中最核心的靶點。一氧化氮（NO）是最具有特征性的內皮源性舒張因子，當內皮細胞釋放NO的能力降低時，可能導致動脈粥樣硬化和冠心病等一系列事件[10]，因此，NO在內皮細胞對冠心病的保護中起關鍵作用[11]。內皮細胞通過提高NOS3的活性來對抗凝血酶和血小板產物的作用在體內外都得到了證實[10]。研究發(fā)現，在心肌梗死的發(fā)展過程中，NOS3生成減少及活性降低可導致cAMP產生增加，激活蛋白激酶A（PKA）導致L型鈣通道的磷酸化和隨后的鈣內流，進而導致血管平滑肌收縮[12]。應用丹參的主要成分丹酚酸B處理可降低H9C2細胞（胚胎大鼠心室肌源性細胞系）Ca2+和cAMP，抑制PKA[13]，從而發(fā)揮舒張血管平滑肌的功能。

5-HT受體分為14種亞型[14]，其中5-HT2A受體在中樞和外周神經系統中介導多種不同的5-HT生理功能，將其阻斷是治療精神分裂癥、失眠和缺血性心臟病等多種疾病的有效方法[15]。血管平滑肌細胞的增殖和遷移與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制相關。5-HT可激活血管平滑肌細胞5-HT2A受體，通過內皮細胞中5-HT1B受體的NO依賴機制而引起血管收縮[16]。5-HT2A受體還可以增加細胞內Ca2+水平，釋放細胞內儲存的Ca2+和/或激活L型Ca2+通道[17]。因此，參松養(yǎng)心膠囊對于冠心病的治療可能是通過激活NOS3并阻斷5-HT2A受體而實現。同時，KEGG信號通路富集分析也發(fā)現參松養(yǎng)心膠囊對于冠心病的治療在5-HT神經突觸、鈣離子信號通路最為突出。這一與本研究上述的結果一致。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法，對參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的作用機制進行了初步研究。結果表明，參松養(yǎng)心膠囊主要通過丹參，輔以其他中藥，激活NOS3并阻斷5-HT2A受體，同時通過5-羥色胺能突觸、鈣離子信號通路發(fā)揮治療冠心病的作用。本研究為參松養(yǎng)心膠囊的進一步的基礎與臨床的研究提供了理論支持。