姜玉婷 孫雯雯 李 佳 劉西鵬 徐麗君 劉光海 張毅芳▲

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，山東泰安 271000；2. 山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，山東泰安 271000；3. 山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東泰安 271000

子宮內(nèi)膜癌是女性常見的惡性腫瘤，在我國生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中其發(fā)病率僅低于宮頸癌，而在美國其發(fā)病位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首，子宮內(nèi)膜腺癌是最常見的類型。子宮內(nèi)膜癌大多早期發(fā)現(xiàn)，預(yù)后較好。但具有低分化等高危因素的患者，治療難度增加，術(shù)后多需輔助放療或化療，預(yù)后不佳。近年來一些副反應(yīng)小、攝入方便的中藥在腫瘤治療中研究增多。小檗堿（berberine，BB），又稱黃連素，屬于季銨生物堿，異喹啉類，以往臨床上主要用于治療胃腸炎、細(xì)菌性痢疾等，近年來發(fā)現(xiàn)小檗堿還具有免疫調(diào)節(jié)等作用。在腫瘤的研究中，相應(yīng)濃度小檗堿作用腫瘤細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞生長受到抑制[1]。本研究探討小檗堿對低分化子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞AN3CA的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞系及主要實(shí)驗(yàn)試劑：細(xì)胞系，低化子宮內(nèi)

膜癌細(xì)胞AN3CA來自山東第一醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究中心保存；小檗堿，產(chǎn)品編號：S583634，購買自Sigma；MEM培養(yǎng)基，產(chǎn)品編號：31985070，自Gibco購買；胎牛血清，產(chǎn)品編號：10099，自Gibco購買；二甲基亞砜DMSO，產(chǎn)品編號：C6164，自Sigma購買；Tanswell小室，產(chǎn)品編號：CLS3381，自Merck Millipore購買；Matrigel（基質(zhì)膠），產(chǎn)品編號：114-550，自Merck Millipore購買；Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，產(chǎn)品編號：BB-4101，自貝博生物公司購買。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及小檗堿配置 人低分化子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞AN3-CA復(fù)蘇、培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)基中，放置于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度37℃，2～3 d傳代1次，每2天換液。細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將小檗堿溶于二甲基亞砜（DMSO），配為1 mmol/L的溶液，實(shí)驗(yàn)使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋小檗堿至最終濃度分別為10、20、40、80 μmol/L，取不加小檗堿的培養(yǎng)基為陰性對照（0μmol/L）[2]。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖 AN3CA細(xì)胞復(fù)蘇，接種于96孔板，濃度調(diào)整為：細(xì)胞液100 μl，含5×103細(xì)胞。用梯度濃度0、20、40、80μmol/L小檗堿作用24、48、72 h后，加入MTT液，濃度5 mg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h，吸上清，加入DMSO溶解。采用550 nm波長，測定OD（光密度）值，應(yīng)用如下公式：（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。SPSS計(jì)算50%抑制濃度（IC50）。

1.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 取400個(gè)對數(shù)生長期AN3CA細(xì)胞，接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過夜，以0、20、40 μmol/L小檗堿作用48 h后換液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d后倒掉培養(yǎng)基，固定、染色，觀察并記錄直徑＞10 mm的細(xì)胞克隆數(shù)目。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 血清培養(yǎng)基饑餓AN3CA細(xì)胞12 h，以0、20、40 μmol/L小檗堿作用48 h后換液，取Transwell小室，懸浮細(xì)胞，上室細(xì)胞培養(yǎng)基中不加血清，密度約為1.5×105/ml（細(xì)胞液200 μL），下室加入600 μL培養(yǎng)基（含有10%的胎牛血清）。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽輕輕除去濾膜上層未侵襲的細(xì)胞，PBS沖洗、固定、染色，顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞的數(shù)目。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 對數(shù)生長期的AN3CA細(xì)胞，接種于6孔按板中，隔日換液，加入分別含0、20、40、80 μmol/L小檗堿濃度的培養(yǎng)基作用48 h，以3孔作為1組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，100 μL緩沖液懸液，避光，加入5 μl Annexin PE，5 μl PI，室溫孵育，15 min，篩網(wǎng)過濾，上流式細(xì)胞儀，檢測細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對AN3CA細(xì)胞形態(tài)的影響

正常AN3CA 細(xì)胞形態(tài)規(guī)整、飽滿，多邊形，細(xì)胞胞質(zhì)豐富，貼壁緊密。應(yīng)用小檗堿作用后且隨作用濃度及作用時(shí)間逐漸增加，細(xì)胞體積開始逐漸縮小，變圓，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，貼壁不緊密同時(shí)排列稀疏。見圖1A。

2.2 MTT法檢測小檗堿對 AN3CA 細(xì)胞增殖的影響

梯度濃度小檗堿作用AN3CA 細(xì)胞24、48、72 h，分別測550 nm波長處測定OD值。按（實(shí)驗(yàn) 組OD值/對 照 組OD值）×100%計(jì) 算 細(xì) 胞存活率（%）。相對于對照組，梯度濃度10、20、40、80 μmol/L小檗堿作用細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活 率 分 別 為（95.27±3.32）%、（89.13±0.76）%、（87.84±2.37）%、（74.39±1.71）%。作用48 h后，細(xì)胞存活率分別為（77.48±3.83）%、（70.45±1.36）%、（48.76±3.15）%、（41.84±5.14）%。作用72 h后，細(xì)胞存活率分別為（63.47±5.55）%、（47.38±3.147）%、（26.37±1.19）%、（19.48±1.34）%。10 μmmol /L小檗堿作用細(xì)胞24 h后所測得細(xì)胞OD值與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），其余各濃度組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。10、20、40、80 μmol/L小 檗 堿 作 用 細(xì) 胞48 h及72 h后所測得細(xì)胞OD值與同作用時(shí)間對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。小檗堿以濃度和時(shí)間依賴抑制AN3CA細(xì)胞生長。見圖1B。SPSS25.0計(jì)算出小檗堿計(jì)算出72 h50%抑制濃度13.5 μmol/L。選擇20、40 μmol/L小檗堿進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 平板克隆形成檢測小檗堿對AN3CA細(xì)胞增殖的影響

取0、20、40μmol/L小檗堿作用AN3CA細(xì)胞后，細(xì)胞形成克隆數(shù)分別為（761.7±45.7）、（584.6±58.2）、（207.0±36.0）。20、40 μmol/L組分別與0 μmol/L組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。小檗堿劑量越高對AN3CA細(xì)胞克隆形成抑制越強(qiáng)。見圖1C、1D。

圖1 小檗堿抑制AN3CA細(xì)胞增殖能力（A、B）及克隆形成能力（C、D）

2.4 Transwell 檢測細(xì)胞體外侵襲能力

取0、20、40 μmol/L小 檗 堿 作 用AN3CA細(xì)胞后，細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（139.7±11.1）、（110.0±5.1）、（56.7±6.5），20、40 μmol/l組 分 別 與0 μmol/L組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。隨著小檗堿濃度的增加，其對AN3CA 細(xì)胞體外侵襲的抑制能力增強(qiáng)。見圖2。

圖2 小檗堿抑制AN3CA細(xì)胞侵襲能力

2.5 小檗堿對 AN3CA 細(xì)胞凋亡的影響

0、20、40μmol/L小檗堿作用AN3CA細(xì)胞后，人子宮內(nèi)膜腺癌AN3CA細(xì)胞24 h后AN3CA細(xì)胞總凋亡率分別為（10.37±1.16）%、（46.91±2.48）%、（54.73±1.39）%，20、40 μmol/L組分別與0μmol/L組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖3。

圖3 小檗堿促進(jìn)AN3CA細(xì)胞凋亡

3 討論

子宮內(nèi)膜癌在我國發(fā)病率僅次于宮頸癌，今年我國新發(fā)病例8.5萬余例，導(dǎo)致1.7萬余人死亡[3]。美國發(fā)病率已超越宮頸癌，位居?jì)D科惡性腫瘤首位，2018年新發(fā)子宮內(nèi)膜癌約6.6萬例，導(dǎo)致1.2萬余人病死，病死率占同年惡性腫瘤病死患者3%[4]。如何更好治療低分化、晚期子宮內(nèi)膜癌是婦科腫瘤的研究熱點(diǎn)。

多種腫瘤研究中，小檗堿表現(xiàn)出腫瘤抑制作用[5]。其機(jī)制可能有：①導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯；②促進(jìn)細(xì)胞凋亡；③引起細(xì)胞自噬抑制端粒酶活性[1]；④與微RNA相互作用來抑制細(xì)胞增殖[6]；⑤抑制EMT[7]；⑥下調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白和信號通路的表達(dá)等[8]。與小檗堿發(fā)揮作用相關(guān)信號通路有①AMP活化蛋白激酶；②絲裂原活化蛋白激酶；③蛋白激酶B通路等[9]。

在婦科惡性腫瘤中研究發(fā)現(xiàn)，隨濃度增加，小檗堿呈現(xiàn)抑制人宮頸癌細(xì)胞生長抑制作用的增強(qiáng)；還能抑制宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲，作用后BAX、Caspase-3表達(dá)升高，而Bcl-2、KRT17表達(dá)降低[10]。HPV為宮頸癌發(fā)生的主要致病因素，約有85%的宮頸癌導(dǎo)致的病死發(fā)生在發(fā)展中國家[11-12]。研究提示小檗堿有望成為治療HPV感染相關(guān)的宮頸癌的潛在藥物[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿通過下調(diào)EGFR-ErbB2/PI3K/Akt信號通路，抑制EGFR和ErbB2下游靶點(diǎn)cyclin D1、MMPs和VEGF的激活及通過泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解誘導(dǎo)ErbB2耗竭兩種途徑降低了卵巢癌細(xì)胞的活動(dòng)能力和侵襲性[14]。小檗堿還可以通過抑制化療激活的GLI1/BMI1信號通路逆轉(zhuǎn)EMT和腫瘤遷移，這提示小檗堿可與化療藥物聯(lián)合使用，以預(yù)防卵巢癌化療期間的轉(zhuǎn)移[15]。

本研究對不同濃度小檗堿對低分化子宮內(nèi)膜癌AN3CA細(xì)胞生長的影響，MTT顯示小檗堿可顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長，呈時(shí)間-劑量依賴性。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測小檗堿對AN3CA細(xì)胞增殖的抑制作用，研究顯示經(jīng)小檗堿作用后細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，檢測顯示藥物作用后細(xì)胞侵襲穿過小室基底膜細(xì)胞數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。以上結(jié)果提示小檗堿抑制了AN3CA細(xì)胞生長，這些結(jié)果與在其他惡性腫瘤研究中研究結(jié)果一致，提示小檗堿能有效抑制低分化子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞AN3CA細(xì)胞增殖及侵襲能力。進(jìn)一步探討其對小檗堿凋亡能力的影響，行流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示小檗堿能明顯促進(jìn)AN3CA細(xì)胞凋亡，小檗堿作用細(xì)胞后細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡及總凋亡率均增加。以上結(jié)果均提示小檗堿對低分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抑制作用。

上述研究結(jié)果提示小檗堿能抑制低分化子宮內(nèi)膜腺癌AN3CA細(xì)胞增殖及侵襲能力，促進(jìn)其凋亡，這可能為中藥小檗堿應(yīng)用于子宮內(nèi)膜癌中的治療提供一定理論依據(jù)，但其確切作用機(jī)制不明，仍需進(jìn)一步研究，同時(shí)需體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，其臨床中的具體應(yīng)用仍需進(jìn)一步討論。