別朋宇，耿予歡

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510641)

豆粕是大豆脫去油脂后的副產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸，但是豆粕由于蛋白高溫變性后人體消化吸收率降低、多種抗?fàn)I養(yǎng)因子等原因目前在食品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用較少[1]。目前對(duì)豆粕的研究集中在利用微生物發(fā)酵提高飼料的消化利用率以及提取大豆肽兩方面，但是從中繼續(xù)分離純化鮮味肽研究較少，這是因?yàn)榇蠖沟鞍追纸夂笤菊郫B在內(nèi)部的苦味氨基酸暴露出來(lái)[2]，苦味閾值低，極大地影響口感，是制備豆源鮮味肽最大的難題。利用微生物法脫苦相比于β-環(huán)糊精掩蓋法、吸附法、酶解法，肽損失率低且成本低。李萍[3]對(duì)比β-環(huán)糊精掩蓋、黑曲霉酶液脫苦、復(fù)合蛋白酶脫苦效果分析，發(fā)現(xiàn)利用黑曲霉酶液中酸性蛋白酶不僅脫苦效果最好，多肽損失量也最低。李楊等[4]利用黑曲霉、米曲霉、毛霉混合蛋白酶液對(duì)大豆肽進(jìn)行脫苦，效果顯著。

鮮味是酸、甜、苦、咸、鮮五大基本味覺(jué)之一，可以提高人的食欲和愉悅感。近年來(lái)，鮮味肽以其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、鮮味濃厚、易于吸收等特點(diǎn)而受到大家的青睞，也是復(fù)合鮮味調(diào)味品的重要組成部分[5-7]。范海茹等[8]通過(guò)內(nèi)切酶中性蛋白酶和外切酶復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶連續(xù)酶解的方式從豆粕中分離出了類似I+G的鮮味肽，這為直接從豆粕中提取鮮味肽提供了可能，但是商業(yè)酶不適合工業(yè)化生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)將豆粕進(jìn)行黑曲霉和米曲霉雙菌制曲酶解，然后通過(guò)乙醇分級(jí)、葡聚糖凝膠層析分離純化，聯(lián)合感官評(píng)價(jià)得到了鮮味較強(qiáng)的豆粕鮮味肽，探究豆粕鮮味肽的制備和苦味的脫除，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

豆粕曲料(米曲霉∶黑曲霉為3∶1雙菌制曲)：由廣東某調(diào)味品公司提供。

1.2 試劑

檸檬酸、蔗糖、L-亮氨酸、食鹽、味精(食品級(jí)感官評(píng)價(jià)標(biāo)品)：廣州化學(xué)試劑廠；Sephadex G-15葡聚糖凝膠(色譜純)：美國(guó)GE公司；無(wú)水乙醇(分析純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

HZ-9212BV真空冷凍干燥機(jī) 江蘇瑞宇實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Φ2.6 cm×60 cm玻璃層析柱 北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 曲料基本成分的測(cè)定

水分測(cè)定按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.3—2016中“直接干燥法”進(jìn)行檢測(cè)；灰分測(cè)定按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.4—2016中“高溫灼燒法”進(jìn)行檢測(cè)；蛋白質(zhì)測(cè)定按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5511—2008中“凱氏定氮法”進(jìn)行檢測(cè)；脂質(zhì)測(cè)定按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.6—2016中“索氏提取法”進(jìn)行檢測(cè)；總糖測(cè)定采用苯酚硫酸法，參照任曉晨[9]的方法，并做適當(dāng)修改。

1.4.2 酶解曲料

根據(jù)前期探究最佳酶解條件進(jìn)行酶解：曲料料液比為1∶2.1，酶解溫度為44.5 ℃，自然狀態(tài)下酶解5.1 d，所得酶解液經(jīng)4層紗布過(guò)濾，90 ℃滅酶20 min，8 000 r/min離心20 min，取上清液備用。

1.4.3 醇沉分離

參照陳嘉輝[10]的方法，并做適當(dāng)修改。將得到的酶解液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至固形物含量為50%，取500 mL，加入269 mL食用級(jí)無(wú)水乙醇使得乙醇濃度為35%(體積比)，常溫下攪拌30 min，8 000 r/min離心15 min得沉淀物和上清液。沉淀物加水復(fù)溶、旋蒸、凍干得35%乙醇沉淀組分Ⅰ；根據(jù)剩余的上清液體積繼續(xù)加入無(wú)水乙醇，使其乙醇濃度達(dá)到60%，重復(fù)以上操作得到60%乙醇沉淀組分Ⅱ；以此類推得到85%乙醇沉淀組分Ⅲ，最后上清液旋蒸、凍干，命名為上清液組分Ⅳ。

1.4.4 感官評(píng)價(jià)分析

樣品感官評(píng)價(jià)：由本學(xué)院10名品評(píng)員(5男5女，味覺(jué)敏銳)在感官評(píng)價(jià)室對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的樣品溶液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)并打分，規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)品為5分，評(píng)分范圍為5～10分，最后取其平均值記錄在雷達(dá)圖中。選取0.08%檸檬酸溶液、1%蔗糖溶液、0.5% L-亮氨酸溶液、0.7%食用鹽溶液、0.35%味精溶液依次作為酸、甜、苦、咸、鮮的標(biāo)準(zhǔn)品。

豆粕鮮味肽呈味閾值的測(cè)定：采用滋味稀釋分析法[11]測(cè)定豆粕鮮味肽的感官閾值，配制100～500 mg/L以50 mg/L為梯度增加的一系列稀釋液，按由低濃度到高濃度的順序?qū)悠返南♂屢阂来卧u(píng)定，將某稀釋液剛好與純凈水差異被識(shí)別出來(lái)的濃度為此物質(zhì)的呈味閾值，該結(jié)果取多位品評(píng)員的平均值。

豆粕鮮味肽復(fù)合鮮味增強(qiáng)效果測(cè)定：分別配制0.35%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)味精溶液、1%豆粕鮮味肽溶液、0.7%食用鹽溶液、0.35%味精+1%豆粕鮮味肽復(fù)合溶液以及0.7%食用鹽溶液+1%豆粕鮮味肽溶液，以0.35%味精溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，定為5分，分別對(duì)以上溶液打分并取其平均值。

1.4.5 葡聚糖凝膠分離純化

裝柱：將凝膠層析柱豎直固定在鐵架臺(tái)上，先向柱中加入少量蒸餾水排除下端氣泡，葡聚糖凝膠攪拌均勻后立即用玻璃棒引流(一次性沿壁勻速倒入)，待其自然沉降后用水壓實(shí)6 h，當(dāng)凝膠和水面相切時(shí)開(kāi)始進(jìn)樣。

進(jìn)樣：將醇沉分離得到的鮮味最強(qiáng)組分溶于水，配成濃度為50 mg/mL，過(guò)0.22 μm水系濾膜，通過(guò)AKTA蛋白純化儀分離純化，每次進(jìn)樣量為2 mL，流速為1 mL/min，泵壓為0.40 MPa，在214 nm下每4 mL為一管分管收集，然后在同一峰下合并濃縮，凍干成粉，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.6 肽分子量測(cè)定

色譜條件：流動(dòng)相：0.02 mol/L KH2PO4緩沖液；凝膠柱：TSK G-5000 PWXL柱(7.8～300 nm)與TSK G-3000 PWXL柱(7.8～300 nm)串聯(lián)使用；流速：0.6 mL/min；柱溫：35 ℃；儀器：Waters 2414示差檢測(cè)器與工作站GPC。

實(shí)驗(yàn)方法：準(zhǔn)確稱取4 mg樣品，溶于2 mL流動(dòng)相中，用0.45 μm水系濾膜過(guò)濾待用。進(jìn)樣量10 μL，運(yùn)行時(shí)間45 min，利用葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行積分，可得分子量大小分布。

1.4.7 氨基酸組成測(cè)定

分別取200 mg樣品和50 mg磺基水楊酸加蒸餾水混勻定容到2 mL，于4 ℃冰箱中靜置1 h后以10 000 r/min離心15 min，去除沉淀后以同樣的條件再離心1次，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)。

2 結(jié)果與討論

2.1 豆粕曲料中基本成分

檢測(cè)了豆粕曲料中主要成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 曲料中主要成分Table 1 Main components of koji %

2.2 醇沉分離

2.2.1 醇沉分離各組分得率和組成

醇沉各組分得率依次為1.06%、10.99%、5.10%、4.30%，見(jiàn)圖1。組分Ⅱ得率最高，組分Ⅰ最低。各組分物質(zhì)的組成見(jiàn)圖2。隨著乙醇濃度的升高，總糖含量由15%上升到25%，蛋白含量由66%逐漸下降到52%，水分含量隨著總糖含量的增加有輕微上升的趨勢(shì)，但基本維持在20%左右。隨著乙醇濃度的升高，分子量較大的蛋白最先被沉降下來(lái)，其次是分子量較小的蛋白和肽段，隨著沉降次數(shù)的增多，沉淀下來(lái)的蛋白含量也越來(lái)越少。但是發(fā)酵菌種產(chǎn)生的是一個(gè)復(fù)合酶系，除產(chǎn)生蛋白酶外還會(huì)產(chǎn)生糖化酶、淀粉酶等，也會(huì)將豆粕中的多糖進(jìn)行分解進(jìn)入酶解液中，乙醇降低水溶液介電常數(shù)，使多肽脫水聚集的同時(shí)也會(huì)使多糖沉淀，因此各組分含有一定量多糖。

圖1 醇沉各組分得率Fig.1 Yield of each component by alcohol precipitation

圖2 醇沉各組分物質(zhì)組成Fig.2 Composition of each component by alcohol precipitation

2.2.2 醇沉分離各組分感官評(píng)價(jià)分析

醇沉各組分感官評(píng)價(jià)見(jiàn)表2。4個(gè)組分口感差異較大，其中組分Ⅰ具有顯著的醬油氣味，但是口感比較平淡，且最先被低濃度乙醇沉淀出來(lái)，可能主要為分子量較大的蛋白；組分Ⅱ酸味比較突出；組分Ⅲ鮮味突出但是后苦味也比較重；組分Ⅳ苦味很重。

表2 乙醇分離不同組分感官評(píng)價(jià)特性Table 2 Sensory evaluation characteristics of different components by ethanol separation

醇沉組分感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖見(jiàn)圖3。

圖3 醇沉組分感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.3 Sensory evaluation radar diagram of components by alcohol precipitation

2.2.3 醇沉分離各組分氨基酸組成

味覺(jué)重要的呈味基礎(chǔ)物質(zhì)來(lái)源之一是游離氨基酸，游離氨基酸主要影響味覺(jué)受體產(chǎn)生不同的味覺(jué)。Kirimura等[12]將氨基酸主要分為3類：疏水性強(qiáng)的一般為苦味氨基酸，疏水性弱的一般為甜味氨基酸，側(cè)鏈為酸性基團(tuán)的為酸性氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸，二者同時(shí)具有鮮味，也被稱為鮮味氨基酸。研究表明，目前已發(fā)現(xiàn)的鮮味肽中大多數(shù)都含有鮮味氨基酸，鮮味的強(qiáng)弱和鮮味氨基酸的含量密切相關(guān)[13-14]。醇沉分離各組分的氨基酸組成見(jiàn)表3，組分Ⅲ鮮味氨基酸和甜味氨基酸含量都最高，組分Ⅳ苦味氨基酸含量最高，這與感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致。Lioe等[15]對(duì)比分析3種傳統(tǒng)日本醬油中超濾得到<500 Da的最鮮美的部分，發(fā)現(xiàn)含有大量的游離谷氨酸和引起甜味的氨基酸，且濃度高于其閾值。張佳男[16]研究也發(fā)現(xiàn)，甜味氨基酸對(duì)鮮味有較大促進(jìn)作用，可以顯著提高鮮味的厚重味。但組分Ⅲ中苦味氨基酸含量也比較高，如果能將苦味脫除就可得到味道比較鮮的大豆肽。綜上，為了得到豆粕鮮味肽，后續(xù)將鮮味評(píng)分最高的組分Ⅲ進(jìn)一步脫苦提鮮。

表3 醇沉分離各組分氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of each component separated by alcohol precipitation g/100 g

2.2.4 醇沉分離各組分肽分子量分布

醇沉分離各組分分子量分布結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 醇沉分離不同組分肽分子量分布圖Fig.4 Molecular weight distribution of peptides of different components separated by alcohol precipitation注：不同標(biāo)注表示有顯著性差異(P<0.05)。

由圖4可知，4個(gè)組分中分子量<5 000 Da都超過(guò)80%，說(shuō)明最佳酶解條件下大豆蛋白已得到充分酶解。隨著乙醇濃度的升高，1 000～3 000 Da的含量逐漸上升，組分Ⅲ和組分Ⅳ中以1 000～3 000 Da的肽段為主，結(jié)合各組分感官評(píng)分分析，發(fā)現(xiàn)小分子肽含量越高，鮮味評(píng)分越高。研究表明，具有鮮味、苦味等口感主要為分子量在1 500 Da以下的小分子肽[17]；Rhyu等[18]發(fā)現(xiàn)大醬水提物中500～1 000 Da的小分子肽對(duì)其鮮味有顯著影響，這和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。雖然組分Ⅳ中1 000～3 000 Da的含量比組分Ⅲ高，鮮味評(píng)分卻并不高，苦味非常突出，結(jié)合表3可能是因?yàn)槠浜凶罡弑壤目辔栋被?，說(shuō)明鮮味不僅與其分子量有關(guān)，還與其氨基酸組成密切相關(guān)。

2.3 葡聚糖凝膠分離純化

2.3.1 凝膠分離各組分得率及組成

將鮮味評(píng)分最高的醇沉組分Ⅲ通過(guò)Sephadex G-15葡聚糖凝膠得到的分離圖，見(jiàn)圖5。得率及各組分組成分別見(jiàn)圖6和圖7。

圖5 葡聚糖凝膠分離組分Ⅲ響應(yīng)圖Fig.5 Response diagram of component Ⅲ by dextran gel separation

圖6 凝膠層析各組分得率Fig.6 Yield of each component by gel chromatography

圖7 凝膠層析各組分組成Fig.7 Composition of each component by gel chromatography

由圖5～圖7可知，組分Ⅲ經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠Sephadex G-15被先后分離為4個(gè)組分，得率依次為0.94%、3.25%、0.47%、0.06%，其中Ⅲ-2得率最高，這是因?yàn)榇朔肿恿扛浇亩嚯拇罅看嬖?，短時(shí)間內(nèi)被大量洗脫出來(lái)，組分Ⅲ-4雖然保留時(shí)間最長(zhǎng)，但是此組分含量較少，得率較低。凝膠層析各組分多肽含量依次遞增，多糖含量依次遞減，水分含量基本維持在18%左右，其中組分Ⅲ-4多肽含量最高，為70%，組分Ⅲ-1和組分Ⅲ-2多糖含量較高，分別為29%和20%。

2.3.2 凝膠分離各組分感官評(píng)價(jià)分析

對(duì)凝膠分離各個(gè)組分進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 凝膠分離不同組分感官評(píng)價(jià)特性Table 4 Sensory evaluation characteristics of different components separated by gel

結(jié)合表2和表4感官評(píng)分綜合分析，經(jīng)過(guò)凝膠分離，組分Ⅲ的鮮味和苦味被分開(kāi)，鮮味主要集中在組分Ⅲ-2，鮮味評(píng)分由4.80提升到7.23，苦味主要集中在組分Ⅲ-3。因此，組分Ⅲ-2作為目標(biāo)鮮味肽。

凝膠層析各組分感官評(píng)價(jià)見(jiàn)圖8。

圖8 凝膠層析各組分感官評(píng)價(jià)Fig.8 Sensory evaluation of each component by gel chromatography

2.3.3 凝膠分離各組分氨基酸組成

對(duì)凝膠分離各組分進(jìn)行氨基酸分析，結(jié)果見(jiàn)表5。和醇沉各組分氨基酸含量相比，鮮味氨基酸由被分離組分Ⅲ的 8.685 g/100 g提升到組分Ⅲ-2的9.549 g/100 g，苦味氨基酸由被分離組分Ⅲ的10.060 g/100 g變?yōu)榻M分Ⅲ-3的18.541 g/100 g，結(jié)合感官評(píng)價(jià)結(jié)果，說(shuō)明葡聚糖凝膠層析可以使大豆肽鮮味和苦味分離開(kāi)，從而達(dá)到大豆肽脫苦提鮮的目的，此外，組分Ⅲ-2中鮮味氨基酸含量較高，對(duì)其鮮味有很大貢獻(xiàn)作用。雖然組分Ⅲ-3中苦味氨基酸含量約為組分Ⅲ-4的6倍，但是感官評(píng)價(jià)組分Ⅲ-4比組分Ⅲ-3的苦味更重，說(shuō)明苦味的強(qiáng)弱除了與苦味氨基酸含量有關(guān)，還可能與其分子量或者空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。

表5 凝膠分離各組分氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of each component separated by gel g/100 g

2.4 豆粕鮮味肽呈味閾值及其復(fù)配提鮮效果

測(cè)定了豆粕鮮味肽鮮味閾值，并進(jìn)行了豆粕鮮味肽分別與味精和食鹽復(fù)合后鮮味增強(qiáng)效果的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 鮮味肽閾值及其復(fù)配鮮味評(píng)分Table 6 Threshold values of umami peptides and umami scores of their combination

由表6可知，豆粕鮮味肽和味精復(fù)合鮮味評(píng)分比兩者之和要高，味精雖鮮味較強(qiáng)，但缺乏營(yíng)養(yǎng)、后味不足，并且過(guò)量食用將會(huì)引起鈉攝入過(guò)多，增大血壓升高等風(fēng)險(xiǎn)，豆粕鮮味肽和味精復(fù)合彌補(bǔ)了味精后味不足的缺點(diǎn)。鹽乃百味之王，只有在一定鹽濃度下鮮味、醇厚味等滋味才能更好地刺激味蕾受體[19]，與食鹽復(fù)配結(jié)果表明食鹽確實(shí)對(duì)豆粕鮮味肽的鮮味有增強(qiáng)效果，可能與鈉離子和游離谷氨結(jié)合形成谷氨酸鈉有關(guān)。

3 結(jié)論

通過(guò)醇沉分離和葡聚糖凝膠層析可以顯著降低大豆肽的苦味，從而制備出鮮味較強(qiáng)的豆粕鮮味肽，得率為3.25%，制備的豆粕鮮味肽含有較高比例的鮮味氨基酸和甜味氨基酸，其鮮味閾值為350 mg/mL，與味精和食鹽復(fù)配可顯著提高其鮮味和厚重味。以米曲霉和黑曲霉雙菌發(fā)酵制得的豆粕曲料為原料進(jìn)而提取純化出豆粕鮮味肽，擴(kuò)展了豆粕利用的途徑，此方法生產(chǎn)成本低，鮮味肽鮮味較強(qiáng)，為工業(yè)化生產(chǎn)鮮味肽提供了理論依據(jù)。