林 婧，湯 琪，高媛媛

(細胞逆境響應與代謝調控福建省高校重點實驗室/福建師范大學生命科學學院， 福建 福州 350108)

隨著抗生素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)的濫用情況加劇，越來越多的問題逐漸暴露，例如:打破畜禽體內微生態(tài)平衡引起的二重感染、造成畜禽集體免疫減退、對畜禽生存環(huán)境造成潛在的危害等[1-3]。濫用造成的耐藥細菌(antibiotic-resistant bacteria)和耐藥基因(antibiotic resistance genes)快速出現(xiàn)，導致抗生素對畜禽的治療效率大幅度降低[4]。在金黃色葡萄球菌中已出現(xiàn)了耐青霉素、四環(huán)素、紅霉素、萬古霉素、甲氧西林的抗生素菌株[5]，在對畜禽共生大腸桿菌的抗生素耐藥性常規(guī)監(jiān)測中，也發(fā)現(xiàn)了對多粘菌素耐藥性的大腸桿菌[6]，細菌耐藥問題愈發(fā)棘手。為解決該問題，大部分研究人員把目光聚焦于新藥的研發(fā)，然而新藥研發(fā)周期長[7]，僅僅依靠新藥研發(fā)并不能及時解決細菌耐藥問題，同時尋找新的藥理靶點才是問題解決的雙全的策略。在探索新耐藥靶點的過程中，研究者發(fā)現(xiàn)了一些理想的靶點[8]，通常聚焦于細菌一些獨特的能量代謝途徑中，其中涉及到的一些關鍵酶往往發(fā)揮著不可替代的作用[9-10]。而腺苷酸琥珀酸裂解酶PurB(Purine-element-binding protein B)作為大腸桿菌中高度保守的酶[11]，是嘌呤合成中不可或缺的一部分[12]，被預測可作為大腸桿菌的一個的新耐藥靶點。

近年來，已有研究發(fā)現(xiàn)腺苷酸琥珀酸裂解酶突變在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)中對β-內酰胺類抗生素的耐藥具有重要作用[13]。同時，在腸炎沙門氏菌(S.Enteritidis)的研究中發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類藥物(FQs)的耐藥性也與purB基因有關[14-15]。然而目前尚未有研究發(fā)現(xiàn)腺苷酸琥珀酸裂解酶在大腸桿菌中對氨基糖苷類抗生素的耐藥具有貢獻。因此，本試驗擬探討腺苷酸琥珀酸裂解酶對大腸桿菌氨基糖苷類抗生素耐藥性的影響，以評估腺苷酸琥珀酸裂解酶在氨基糖苷類抗生素應激環(huán)境中的作用，希望為解決大腸桿菌耐藥問題提供新的藥理靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用大腸桿菌BW25113菌株以及過表達載體pCA24N。

卡那霉素(50 mg·mL-1)、慶大霉素(25 mg·mL-1)用無菌超純水配制而成，氯霉素(35 mg·mL-1)用分析乙醇配制而成。以上抗生素儲液均用0.22 μm濾膜過濾除菌后備用。

LB液體培養(yǎng)基(每1 L包含氯化鈉10 g、酵母粉5 g、蛋白胨10 g)、0.01 mol·L-1PBS緩沖液(每1 L包含NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.42 g、KH2PO40.27 g)，以上溶液均經過高溫高壓滅菌。LB固體培養(yǎng)基需在LB液體培養(yǎng)基中加入7.5 g瓊脂后高溫高壓滅菌，在培養(yǎng)基溫熱時倒入無菌培養(yǎng)皿中，待凝固后備用。

Western Blot試驗試劑：0.45 μm PVDF Transfer Membranes、1.5 mol·L-1Tris-HCl (pH 8.8)、0.5 mol·L-1Tris-HCl (pH 6.8)、20% Ara溶液、10% SDS溶液、1×TBST緩沖液、6×loading buffer、4% SDS-PAGE濃縮膠、10% SDS-PAGE分離膠、1×轉膜緩沖液、1 mol·L-1IPTG溶液、1×SDS電泳緩沖液、Western Blot封閉液和(PR1100)BCIP/NBT顯色試劑?？贵w為ProteinFind Anti-His Mouse Monocional Antibody和Alkaline Phosp hatase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG(H+L)。

1.2 試驗方法

1.2.1PurB過表達菌株的構建 在本實驗室保藏的ASKA文庫中選取表達載體攜帶PurB基因的JM109菌株，劃線于氯霉素平板后，挑取單克隆于含氯霉素的液體LB中，過夜培養(yǎng)16 h，用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒提取質粒。在野生型大腸桿菌BW25113感受態(tài)細胞中加入1 μL質粒，混勻后冰上靜置30 min。用預熱完全的42℃金屬浴熱激90 s，冰上靜置2 min，加入1 mL液體LB，37℃搖床恢復1 h?；謴秃蟮木喝客坎荚诼让顾?35 μg·mL-1)抗性板上。過夜培養(yǎng)后挑取攜帶purB基因過表達載體的單克隆菌株。將PCR結果長度正確的菌株送尚亞測序公司進行測序，測序結果與NCBI上E.coli K-12菌株的purB基因進行比對。挑取測序成功的單克隆過夜培養(yǎng)后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2免疫印跡法檢測PurB過表達情況 將BW25113-pCA24N、BW25113-pCA24N(purB)按1∶100的接菌比例轉接至含氯霉素抗性的液體LB中，在搖床中培養(yǎng)至OD600≈0.45時加入IPTG(1 mmol·L-1)，繼續(xù)放置在搖床中誘導至OD600≈0.8。誘導后取菌液1 mL，離心機轉速12 000 r·min-1離心2 min，棄上清加入30 μL的10% SDS溶液和30 μL的6×loading buffer，混合均勻，置于100℃的金屬浴上煮沸15 min。用10%的SDS-PAGE凝膠電泳將樣品進行分離，電泳液為1×SDS電泳緩沖液。凝膠電泳結束后，使用PVDF膜進行轉膜。轉膜結束后封閉液封閉1 h。封閉結束后，加入一抗，置于水平搖床上反應30 min后，置于4℃冰箱過夜靜置12 h。過夜后的膜置于垂直脫色搖床上，用1×TBST緩沖液洗滌3次，每次間隔8～10 min。洗滌后置于水平搖床上，加入二抗反應1.5 h，再換置于搖床上，用1×TBST緩沖液洗滌3次，每次間隔8～10 min。最后進行BCIP/NBT試劑顯色。

1.2.3PurB過表達菌株抗生素耐受性檢測 將BW25113-pCA24N、BW25113-pCA24N(purB)預先活化。將活化好的菌液1∶100轉接至含氯霉素液體LB中，置于搖床中培養(yǎng)至OD600≈0.45時加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，繼續(xù)放置于搖床中誘導至OD600≈0.8。取菌液100 μL于EP管中，12 000 r·min-1離心2 min，去上清，用等體積的0.01 mol·L-1PBS緩沖液重懸作為對照樣品備用。取1 mL誘導至OD600≈0.8的菌液于玻璃搖菌管中，分別加入卡那霉素(終濃度為10 μg·mL-1)、慶大霉素(終濃度為5 μg·mL-1)，繼續(xù)置于搖床中培養(yǎng)，1、2 h后取100 μL于EP管中，離心后去上清，用等體積的0.01 mol·L-1PBS緩沖液重懸作為試驗樣品，將以上樣品用緩沖液梯度稀釋后點板，平板在37℃過夜培養(yǎng)12 h，觀察細菌存活情況，根據(jù)菌落計數(shù)，計算存活率。取3次平行試驗的結果進行顯著性分析。

1.2.4PurB過表達菌株最小抑菌濃度(MIC)測試 將活化好的BW25113-pCA24N、BW25113-pCA24N(purB)按1∶100轉接至含氯霉素液體LB中，置于搖床中培養(yǎng)至OD600≈0.45時加入濃度為1 mmol·L-1的IPTG，繼續(xù)放置于搖床中誘導至OD600≈0.8。將抗生素用2倍稀釋法稀釋成相應濃度(0、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg·mL-1)，在無菌96孔板上按照濃度梯度順序每孔加入200 μL抗生素稀釋液，將誘導后的菌液稀釋5倍后，每個孔中加入2 μL稀釋后的菌液即每孔菌量約為105～106Cfu·mL-1，全部上樣完成后，37℃靜置培養(yǎng)24 h。取出96孔板，用槍頭輕輕吹打混勻菌液，在肉眼條件下對光觀察，清澄透光的孔對應的最低抗生素濃度為該菌體外培養(yǎng)最低抑菌濃度(MIC)。

2 結果與分析

2.1 PurB過表達菌株的構建

由圖1可知，所構建的PurB過表達菌株基因長度正確。由圖2可知，目的片段PurB基因測序結果與NCBI上大腸桿菌K-12菌株purB基因一致。由圖3可知，免疫印跡檢測結果顯示BW25113-pCA24N(purB)能夠表達目的蛋白腺苷酸琥珀酸裂解酶。綜上結果表明PurB過表達菌株構建成功。

注：大腸桿菌purB基因長度為1371 bp圖1 BW25113-pCA24N(purB)菌株基因驗證Fig.1 Gene validation of BW25113-pCA24N(purB) strain

注：黑色序列為K-12大腸桿菌purB基因，藍色序列、紅色序列為上下游引物測序結果圖2 BW25113-pCA24N(purB)菌株測序結果Fig.2 Sequencing results of BW25113-pCA24N (purB) strain

注：腺苷酸琥珀酸裂解酶大小約為50.27 kDa圖3 BW25113-pCA24N(purB)菌株Western Blot檢測Fig.3 Western Blot detection of BW25113-pCA24N (purB) strain

2.2 PurB過表達增強大腸桿菌氨基糖苷類抗生素的耐受性

2.2.1慶大霉素處理下BW25113-pCA24N(emp)、BW25113-pCA24N(purB)表型結果 由圖4可知，BW25113-pCA24N(emp)、BW25113-pCA24N(purB)經濃度為5 μg·mL-1的慶大霉素處理0、1、2 h后細胞存活數(shù)的情況。結果顯示：在未處理情況下，PurB過表達株的細胞存活數(shù)與空質粒株生長一致。在慶大霉素處理1 h后，PurB過表達株細胞存活數(shù)比空質粒株多1個數(shù)量級。而處理2 h后，PurB過表達株的細胞存活數(shù)比空質粒株多近100倍。這些結果證明，過表達腺苷酸琥珀酸裂解酶可以提高大腸桿菌提高對慶大霉素的耐受性。

注：**表示P<0.01，差異較顯著。圖4 慶大霉素處理下emp、purB菌株存活率測定Fig.4 Determination of the survival rate of emp and purB strains treated with gentamicin

2.2.2卡那霉素處理下BW25113-pCA24N(emp)、BW25113-pCA24N(purB)表型結果 由圖5可知，BW25113-pCA24N(emp)、BW25113-pCA24N(purB)經濃度為10 μg·mL-1的卡那霉素處理0、1、2 h后細胞存活數(shù)的情況。結果顯示：在未處理情況下，PurB過表達株的細胞存活數(shù)與空質粒株生長一致。在卡那霉素處理1 h后，PurB過表達株細胞存活數(shù)與空質粒株無顯著差異。而處理2 h后，PurB過表達株的細胞存活數(shù)比空質粒株多近100倍。這些結果證明，過表達腺苷酸琥珀酸裂解酶可以提高大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素的耐受性，提高菌群的生存率。

注：*表示P<0.05，差異顯著圖5 卡那霉素處理下emp、purB菌株存活率測定Fig.5 Determination of the survival rate of emp and purB strains treated with kanamycin

2.3 PurB過表達菌株MIC(最小抑菌濃度)的測定

由圖6可知，在卡那霉素處理條件下BW25113-pCA24N(emp)與BW25113-pCA24N(purB)的MIC都為2 μg·mL-1，在慶大霉素處理條件下BW25113-pCA24N(emp)與BW25113-pCA24N(purB)的MIC都為1 μg·mL-1。說明過表達PurB并未改變菌株耐藥性，只是增強了菌株的耐受性。

注：A為卡拉霉素處理，B為慶大霉素處理圖6 emp、purB最小抑菌濃度(MIC)測定Fig.6 Determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of emp and purB strains

3 結論與討論

自1928年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素到現(xiàn)在[16]，抗生素已成為人類不可或缺的藥物。然而隨著抗生素的過度使用，細菌耐藥在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中出現(xiàn)且勢不可擋。細菌主要以3種方式來應對抗生素應激環(huán)境：耐受、耐藥、持留菌，而耐受的產生先于耐藥性[17]。因此為盡早遏制更多的細菌耐藥產生，有必要挖掘出更多的耐受基因，找到合適的新靶點。在耐受菌以及耐藥菌的分類上，主要以MIC來界定。耐受菌能在有效抗生素濃度下存活，但MIC不變，而耐藥菌MIC增加[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)PurB過表達后能增加大腸桿菌在氨基糖苷類抗生素處理下的存活率，并且進一步研究發(fā)現(xiàn)過表達PurB后，與對照相比，其最小抑菌濃度(MIC)并無增加。因此認為過表達PurB能增加大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素耐受性，而不是耐藥性。結合本試驗研究結果，以及之前研究者們發(fā)現(xiàn)的PurB對金黃色葡萄球菌以及腸炎沙門氏菌耐藥性的貢獻，認為PurB在耐藥細菌產生的進程中發(fā)揮了巨大的作用。

目前，已有研究預測，purB基因編碼金黃色葡萄球菌的必須酶，并且研究人員進一步驗證該酶可作為一個潛在的治療靶點[19]。鑒于該酶在大腸桿菌中對氨基糖苷類抗生素耐受性的貢獻，認為這可為細菌耐藥機制研究和靶點問題提供新的思路。